[发明专利]一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液及其制备方法和使用方法

说明书

本发明公开了一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油1‑10g、异丙醇5‑15g、葡萄糖5‑15g、二甲基亚砜1‑10g、谷胱甘肽0.2‑2g、辅酶Q10 0.5‑2g、氨基酸混合物1‑5g、ATP 0.1‑1g，余量为去离子水。本发明的冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法和保护液，使用和制备中不包含胎牛血清，保存后细胞的活力优于或接近含血清的保护液。

技术领域

本发明属于组织冷冻保存领域，具体涉及一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液及其制备方法和使用方法。

背景技术

胎盘(placenta)羊膜、叶状绒毛膜(丛密绒毛膜)和底蜕膜构成。其中羊膜和叶状绒毛膜构成胎盘的胎儿部分，羊膜位于两层胎膜的内层，绒毛膜位于外层。底蜕膜构成胎盘的母体部分。

人羊膜不表达人类白细胞抗原，这种免疫学特性，使得羊膜成为临床上理想的移植材料。1940年De Rotth将带有绒毛膜的新鲜人羊膜移植到眼球表面修复芥末缺损；1995年Kim等采用羊膜移植使化学性损伤后的眼表得以重建。羊膜在眼科的研究和引用不断深入。

因为人胎盘羊膜和绒毛膜的提供和研究及临床试验的分离，人胎盘羊膜和绒毛膜的保存成为比不缺少的环节，也是关键环节。专利CN201210288706.3(公开号：CN102763642A，专利名称：一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法)公开了一种人胎盘羊膜和绒毛膜的冷冻保护液及冷冻方法，该保护液由胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40组成，胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40的体积比为7-9:1:1。此种冷冻保护液中需要用到胎牛血清，因为疯牛病和一些宗教的原因，一些人不愿意接受此种冷冻保护液冷冻保存的移植材料。

发明内容

针对上述问题，本发明提出了一种新的冷冻保护液及其冷冻方法，不含胎牛血清。

本发明的第一方面在于提供一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的保护液，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油1-10g、异丙醇5-15g、葡萄糖5-15g、二甲基亚砜1-10g、谷胱甘肽0.2-2g、辅酶Q10 0.5-2g、氨基酸混合物1-5g、ATP 0.1-1g，余量为去离子水。

优选的，所述氨基酸混合物包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺。

进一步优选的，所述氨基酸混合物的精氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺的重量比例为2:1:2:2:3。

优选的，每100ml保护液主要由以下各成分组成：甘油5g、异丙醇10g、葡萄糖10g、二甲基亚砜5g、谷胱甘肽1g、辅酶Q10 1g、氨基酸混合物3g、ATP0.5g，余量为去离子水。

本发明的第二方面在于提供一种第一方面所述的保护液的制备方法，包括以下步骤：

S11，取一半目标体积的去离子水，加入葡萄糖，溶解后，加入甘油和异丙醇，搅拌均匀，121℃湿热灭菌，得到基质A；

S12，谷胱甘肽、辅酶Q10、氨基酸混合物和ATP用十分之一目标体积的去离子水溶解，搅拌均匀，过滤灭菌，得到基质B；

S13，无菌条件下，基质B与基质A混合，用无菌的去离子水定容至目标体积，得到保护液。

本发明的第三方面在于提供一种第一方面所述的保护液的使用方法，包括以下步骤：

S21，母体无HIV、HBV的自然生产或剖腹产的人胎盘，用有齿镊轻轻的分离开羊膜和绒毛膜，洗尽血液，剔除血管，并剪成1.0～2.0mm3小块，用无菌生理盐水冲洗羊膜和绒毛膜3次；

S22，保护液预冷到-20℃；

S22，羊膜和绒毛膜转移到冷冻管中，加入预冷的保护液至液面没过羊膜和绒毛膜2-3cm，冷冻管的使用高度不超过1/2；