[发明专利]一种检测FLT3-D835基因的试剂盒与应用

说明书

本发明涉及一种检测FLT3‑D835基因的试剂盒，包括：针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的正向引物、针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的反向引物、PCR反应液Mix、纯水、EcoRV内切核酸酶及内切核酸酶缓冲液；相较于传统的D835酶切方法，本发明在自行设计引物的基础上，通过设计和调整酶切反应体系中酶活力单位与扩增产物的比例，可以提高内切酶对特异性序列的识别度；通过将酶切产物进行适当的预处理，可以降低检出结果模棱两可的现象。通过本发明所提供的在D835酶切过程中进行适当设计和改进，可以有效降低甚至消除D835野生型序列的阳性检出率，并且使检出结果更加明晰，同时为临床标本检测时常出现的假阳性问题和结果不明问题提供了解决方案。

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种检测FLT3-D835基因的试剂盒与应用。

背景技术

D835基因点突变是急性髓系白血病FLT3基因最重要的突变形式，突变频率占7％。野生型D835保留了EcoRV(一种限制性内切核酸酶)的酶切识别位点，可以被EcoRV识别并切开，电泳后产生短片段；突变型D835基因由于丧失了EcoRV特异性识别位点，所以不能被EcoRV酶切掉，电泳后产生长片段。在酶切反应中，需要对过程进行质控，所以要在引物区域的任意一点设计被EcoRV识别的内标序列，在D835基因野生/突变当中，内标序列总是被EcoRV识别并被切开。

用于检测FLT3-D835基因野生型位点的常规的检测方法，是在酶切后产生弱阳性结果，具体表现在所扩增的D835基因片段，有一部分不包含内标序列的识别序列总不被EcoRV识别并被切开。作为一种用于体外诊断的试剂盒，在检测临床标本中出现的假阳性过程中会降低试剂盒使用的准确性，对临床检测结果产生负面影响，特别对于D835基因突变丰度极低的标本来说，不能准确的判读实验结果，协助临床医生给出明确的治疗方案。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供FLT3-D835基因酶切反应体系的设计与应用的技术方法。该技术方法是采用了改进的酶切反应方法，包括针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC引物的设计，包含有EcoRV内切核酸酶识别序列的FLT3-D835基因扩增产物酶切反应体系的改进，酶切产物电泳检测前的预处理三个过程。经过设计与改进，本发明可以消除野生型D835基因酶切后产生的假阳性质控结果，为临床标本提供更加明确的检出结果，更好对发生低丰度D835基因突变的患者进行用药指导，临床应用价值潜力巨大。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种检测FLT3-D835基因的试剂盒，包括：针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的正向引物、针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的反向引物、PCR反应液Mix、纯水、EcoRV内切核酸酶及内切核酸酶缓冲液；

所述针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计正向引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No1：

5’-CAGGAAACAGCTATGACCAGGAACGTGCTTGTCACCC-3’

所述针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计反向引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No2：

5’-ACGACGGCCAGTGATATCATAGCAGCCTCACATTGCCC-3’；

经EcoRV内切核酸酶识别位点的正向引物SEQ.ID.No1和反向引物SEQ.ID.No2PCR扩增后的D835扩增产物用于设计酶切反应体系进行酶切反应，酶切产物经处理过程预处理后用于电泳检测。

在上述方案的基础上，扩增后的FLT3-D835产物序列均包含EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC。