[发明专利]一种提高重组DNA片段转化大肠杆菌效率的方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种提高DNA重组片段转化大肠杆菌效率的方法，即将PCR扩增得到的EGFP片段与pUC18质粒分别进行双酶切，用T4DNA连接酶对酶切后的EGFP片段和pUC18质粒进行连接，得到连接产物；DNA连接产物先加入1/5DNA连接产物体积的10M醋酸铵；然后加入上述混合物两倍体积的无水乙醇，室温静置25min‑1hr，10000g离心25min‑1hr；弃上清，加入5‑10μL 0.1M CaCl₂，溶解管底的沉淀。本发明转化得到的大肠杆菌单克隆数目约是未处理组的2‑10倍；本发明减少了转化时感受态大肠杆菌的使用量。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种提高重组DNA片段转化大肠杆菌效率的方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：DNA重组载体构建是现代生物学研究常规手段之一。在DNA重组载体构建中，目的DNA片段与载体连接后的DNA 连接产物需要转化进入大肠杆菌并筛选得到含有重组DNA的单克隆。CaCl₂法是DNA转化进入大肠杆菌常用方法之一，但DNA连接产物转化大肠杆菌的效率往往较低。DNA连接产物中，除了核酸，还含有DNA连接酶和其他非重组载体成分(包括了Tris、MgCl2、ATP、DTT等)，当DNA连接产物与感受态大肠杆菌混合时，DNA连接酶和其他离子成分，如Tris，Mg²⁺等，可能是影响大肠杆菌感受态细胞活性的重要因素。如果在将DNA连接产物转化大肠杆菌之前，对DNA连接产物进行适当的处理，如乙醇沉淀DNA，可去除或者减少DNA 连接酶和其他非重组载体成分，则可能有利于重组DNA转化进入大肠杆菌，进而提高DNA连接产物转化大肠杆菌的效率。

传统的DNA乙醇沉淀法常用于质粒提取等实验，但其方法中的一些步骤，如70％洗涤沉淀，TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀等并不太适合对DNA连接产物进行沉淀处理。通常对于微量DNA样品，传统的乙醇DNA沉淀法容易造成DNA 样品的损失。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有的DNA连接产物转化大肠杆菌的效率低，且传统的DNA乙醇沉淀法不能有效的纯化DNA连接产物。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明通过改进DNA乙醇沉淀法，提供了一种提高DNA重组片段转化大肠杆菌效率的方法。

本发明是这样实现的，一种提高重组DNA片段转化大肠杆菌效率的方法，所述提高重组DNA片段转化大肠杆菌效率的方法是将PCR扩增得到的EGFP 片段与pUC18质粒分别进行双酶切，用T4DNA连接酶对酶切后的EGFP片段和pUC18质粒进行连接，得到DNA连接产物；10μL连接产物中加入2μL 10M 醋酸铵；然后加入24μL无水乙醇，室温静置25min，10000g离心25min；弃上清，加入10μL 0.1M CaCl₂，溶解管底的沉淀，通过对DNA的沉淀处理，可以去除残留的DNA连接酶和其他非重组载体成分，减少它们对重组DNA转化大肠杆菌的干扰，从而有利于提高DNA连接产物转化大肠杆菌的效率。

进一步，所述EGFP片段摩尔数：pUC18质粒摩尔数≈8:1。以保证尽可能多的pUC18质粒可与EGFP片段连接成为重组载体。

进一步，所述连接之前需要：用PCR方法，扩增出pEGFP-C3载体上的EGFP 片段；用HindⅢ和EcoRⅠ两种内切酶，对EGFP片段和pUC18质粒分别进行双酶切，得到带有相同粘性末端的EGFP片段和pUC18质粒。