[发明专利]从还原性糖的肼类发色试剂衍生物中再生还原性糖的方法

说明书

本发明公开了从还原性糖的肼类发色试剂衍生物中再生还原性糖的方法，包括：(1)取还原性糖，按照摩尔数不小于10倍还原性糖的量加入肼类发色试剂，然后溶于有机溶剂的弱酸水溶液中，摇匀，加热进行反应，反应结束后浓缩干燥；(2)将步骤(1)得到的样品加水溶解，然后用有机溶剂萃取，或者过C18柱和/或PGC固相萃取柱进行纯化；(3)将步骤(2)得到的样品通过色谱法进行分离；(4)将步骤(3)收集的单个糖类衍生物级分干燥，然后溶于弱酸水溶液中，在加热的条件下脱除肼类发色试剂标记物，再生还原性糖链。本发明的有益之处在于：操作简单，反应温和、快速；再生的还原性糖链单体中无副反应产物的产生，且回收率高。

技术领域

本发明涉及一种再生还原性糖的方法，具体涉及一种从还原性糖的肼类发色试剂衍生物中再生还原性糖单体的方法，属于生物化学技术领域。

背景技术

糖基化是一种普遍的翻译后修饰之一，在细胞生命活动的调控中发挥着重要作用。研究报道糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖等糖链缀合物在生物体内参与多种分子间的相互作用，而糖链作为缀合物上的一种信息分子，不仅参与了细胞识别、黏着、细胞之间的信号转导和免疫应答，还在炎症及自身免疫疾病、老化、癌细胞异常增殖及转移、病原体感染等过程中起重要作用。因此，对糖链结构和功能分析具有重要意义。然而，由于糖链的生物合成过程具有非模板性，导致其结构高度复杂，在单糖组成、连接方式、分支位点及异头构型方面都具有多样性，而且糖链具有微不均一性，各种不同结构的糖链往往混合存在，对结构解析和功能分析构成了巨大挑战。

近年来，高灵敏度、高分辨率的生物质谱技术(MS)、高效液相色谱分离技术(HPLC)以及糖芯片等技术的发展，为糖链分析研究提供了重要手段。糖链结构与功能分析的一般过程是：糖链先通过酶法或化学法从动植物来源的糖缀合物中释放，然后纯化，纯化后的糖链再进行衍生化用于质谱分析和液相分离检测，分离的糖链衍生物再通过脱标记过程(再生)得到还原性糖链，这些再生的(回收的)还原性糖链可进一步通过核磁共振、糖芯片等技术进行多样化分析。在这一过程中，从色谱分离所得到的各种糖链衍生物中回收具有单一结构的还原性寡糖链是一个非常关键的环节。未衍生的糖链通常由于缺少相应的疏水和发色基团，难以用于高灵敏度的质谱和色谱检测分析，因此，通常需要以特定的衍生化试剂对糖链进行衍生化，这样不仅可使糖链带上发色基团，便于紫外或荧光检测，同时又能够使糖链带上疏水基团，从而降低糖链的极性，使糖链在色谱柱上得到较好的保留，利于糖链的分离。目前最常用的衍生化试剂都带有伯氨基，如2-氨基吡啶(2-AP)、2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基吖啶酮(2-AMAC)和2-氨基苯甲腈(o-ABN)等，它们可通过还原胺化法与糖链还原端的羰基(醛糖或酮糖)在酸性条件下反应生成席夫碱，进而在还原剂的作用下反应生成稳定的具有二级胺(-C-NH-)结构的衍生物。然而，当这些糖链衍生物以色谱方法进行分离后，脱除试剂回收还原性糖链通常难度较大。由于二级胺(-C-NH-)结构十分稳定，一般需要以过氧化氢对其亚氨基进行氧化才能达到断裂目的，反应条件苛刻，副产物产率很高，回收的还原性糖链产率很低。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)及1，3取代的吡唑啉酮类化合物如PMPMP也常用于糖链的HPLC柱前衍生化，它们是通过活性亚甲基与糖链还原端醛基在碱性条件下发生缩合反应生成带有-C＝C-或-C-C-结构的衍生物，这种结构十分稳定，很难实现还原性糖链的再生。因此，从糖链衍生物中回收还原性糖链仍然是糖链研究中的一个亟待解决的瓶颈问题。

肼类发色试剂是一类研究较少的衍生化试剂，也可以用于还原性糖链的衍生化。其原理是：试剂所携带的肼基基团(-NH-NH₂)在弱酸条件下可与糖链还原端醛基发生亲核反应，形成具有一定稳定性的腙类(-C＝N-NH-)衍生物，可用于糖链的色谱分离和质谱检测。同时，色谱分离后的腙类物质在弱酸性条件下通过加热可发生水解反应，生成具有还原端醛基的糖链。肼类试剂有苯肼(PNH)、吉拉德试剂P(GP)、苯甲酰肼(BZH)和苯磺酰肼(BSH)等，在理论上它们应该都可以对还原性糖链进行衍生化，并且可实现衍生物的色谱分离后脱标记，从而再生还原性糖链。

发明内容