[发明专利]一种特异性检测血清中真菌的试剂及其制备方法

说明书

发明人提供了一种特异性检测血清中真菌的试剂，所述试剂的组分包括多粘菌素和鲎试剂。上述技术方案通过在鲎试剂内添加多粘菌素，多粘菌素含有带阳电荷的游离氨基，能与革兰氏阴性菌酯多糖(LPS)也就是细菌内毒素(endotoxin)的磷脂中带阴电荷的磷酸根结合，而使细菌内毒素失活，失活的脂多糖无法与鲎试剂中C因子起反应，从而阻断了C反应，避免了真菌检测中的假阳性结果。多粘菌素对鲎试剂中其他成分及检测血清中其他组分不会发生交叉反应。

技术领域

本发明涉及生化领域，特别是一种特异性检测血清中真菌的试剂及其制备方法。

背景技术

鲎试剂主要成分包括C因子(Factor C，FC)、B因子(Factor B，FB)、G因子、凝固酶原(Proclotting enzyme)、凝固蛋白原(或显色基质)以及二价阳离子、缓冲盐等。其酶的级联反应基本原理已被广泛研究，包括两条凝集反应途径：一条是由1,3-β-D-葡聚糖介导的G因子(FG)途径，活化的G因子将凝固酶原(Proclotting enzyme)转化为凝固酶(clottingenzyme)，凝固酶再水解显色基质(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA),使其游离出对硝基苯胺(pNA)，此时再经过偶氮化反应生成玫瑰红色偶氮物质，在545nm处有吸收峰。另一条是内毒素介导的C因子途径：C因子(FC)结合内毒素而被激活，然后激活B因子，活化的B因子将凝固酶原(Proclotting enzyme)转化为凝固酶(clotting enzyme)，产生假阳性反应。鲎试剂C、G反应体系图程见附图1。

由于真菌细胞壁的主要成份是(1-3)-β-D-葡聚糖，所以当(1-3)-β-D-葡聚糖与鲎试剂中G因子反应时，就会激活G因子，但是鲎试剂中也同时存在能与血清中细菌内毒素反应的C因子。因此，目前技术中，在用鲎试剂进行血清真菌检测时，必须对鲎试剂进行层析纯化，除去C因子或/和B因子，但该过程较为复杂，收率较低，G因子和其他组分也会造成一定的损失。

发明内容

为此，需要提供一种可以特异性检测血清中真菌的试剂，该试剂屏蔽鲎试剂与血清中内毒素结合的C反应，使之可以特异性的进行真菌检测，避免内毒素产生的假阳性。同时，制备过程简单适合生物医药工业大范围推广，推动鲎试剂检测产业的发展。

为实现上述目的，发明人提供了一种特异性检测血清中真菌的试剂，所述试剂的组分包括多粘菌素和鲎试剂。

细菌内毒素结构为脂多糖，它主要的活性中心是其中的类脂A、类脂A主要由β(1-6)氨基葡双糖组成。其中1，4’位与磷酸相结合，7个分子的脂肪酸是由糖的羟基与氨基结合而成，主要为带阴离子电荷基团。我们发现多粘菌素含有带阳电荷的游离氨基，能与革兰氏阴性菌酯多糖(LPS)也就是细菌内毒素(endotoxin)的磷脂中带阴电荷的磷酸根结合，而使细菌内毒素失活。失活的脂多糖就无法与鲎试剂中C因子起反应。

进一步地，所述多粘菌素的的添加量为4.0mg/ml鲎试剂。

发明人将多粘菌素E溶解于鲎试剂后，1:1做中和细菌内毒素实验，试验结果如下表所示：

根据临床上人的血清中细菌内毒素限值为0.03Eu/ml；患者血清中内毒素值A在0.03Eu/ml＜A＜0.2Eu/ml之间，用内毒素含量0.2Eu/ml的血清作为检测血清，向检测血清中添加不同浓度的多粘菌素。

根据上表显示，当多粘菌素浓度为4.0mg/ml时，基本能中和血清中的细菌内毒素0.015Eu/ml,使旁路反应，即使血液中存在细菌内毒素也不会影响鲎试剂中。

进一步地，所述多粘菌素为多粘菌素E。

发明人还提供了一种特异性检测血清中真菌的试剂制备方法，包括以下步骤：