[发明专利]一种适用于In-Fusion克隆的pGADT7-In载体及其构建和使用方法

权利要求书

1.一种适用于In-Fusion克隆的pGADT7-In载体，其特征在于，所述pGADT7-In载体是由pGADT7载体定点突变获得，pGADT7-In载体和pGBKT7载体上多克隆位点中EcoRⅠ酶切位点的上下游具有一段长15bp的相同序列；

所述pGADT7-In载体和pGBKT7载体上多克隆位点中EcoRⅠ酶切位点的下游具有一段长15bp的相同序列，该序列的正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示；

pGADT7-In载体的构建方法为利用pGBKT7载体上多克隆位点中EcoRⅠ酶切位点下游长15bp的序列，对pGADT7载体上多克隆位点中EcoRⅠ酶切位点下游的序列进行替换，获得pGADT7-In载体。

2.根据权利要求1中所述的pGADT7-In载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：设计正向引物和反向引物，正向引物和反向引物分别包含pGBKT7载体上多克隆位点中EcoRⅠ酶切位点下游长15bp以上的正向序列和反向序列；

步骤2：以pGADT7载体为模板，使用步骤1中的正向引物和反向引物，进行PCR扩增；

步骤3：清除PCR扩增产物中的模板，得消化产物；

步骤4：将消化产物转化大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有抗生素的固体LB平板上进行筛选；

步骤5：挑取单克隆，用含有抗生素的LB液体培养基进行扩大培养，提质粒；

步骤6：对步骤5得到的质粒进行测序确认，序列正确的为pGADT7-In载体。

3.根据权利要求2所述的pGADT7-In载体的构建方法，其特征在于，步骤1中所述正向引物和所述反向引物分别包含如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。

4.根据权利要求2所述的pGADT7-In载体的构建方法，其特征在于，步骤3中使用DpnⅠ酶清除PCR扩增产物中的模板。

5.基于权利要求1中所述的pGADT7-In载体的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：PCR扩增诱饵蛋白基因和猎物蛋白基因，PCR扩增使用的正向引物中含有如SEQID NO.3所示的重组臂接头序列，反向引物中含有如SEQ ID NO.4所示的重组臂接头序列；

步骤2：线性化pGBKT7载体和pGADT7-In载体，得到线性化的pGBKT7载体和线性化的pGADT7-In载体；

步骤3：将步骤1中的诱饵蛋白基因的PCR扩增产物与线性化的pGBKT7载体进行In-Fusion反应，将猎物蛋白基因的PCR扩增产物与线性化的pGADT7-In载体进行In-Fusion反应；

步骤4：将步骤3得到的反应产物分别转化大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有抗生素的固体LB平板上进行筛选；

步骤5：挑取单克隆，分别在含有抗生素的LB液体培养基进行培养；

步骤6：使用引物Yu03和Yu04对含有pGADT7-In载体的菌液进行PCR检测，使用引物Yu03和Yu05对含有pGBKT7载体的菌液进行PCR检测，引物Yu03、Yu04和Yu05的核苷酸序列如SEQID NO.5～7所示；然后对检测正确的克隆扩大培养，提质粒，即得到诱饵载体和猎物载体。

6.根据权利要求5所述的pGADT7-In载体的使用方法，其特征在于，还包括步骤7：将步骤6得到的诱饵载体和猎物载体转化酵母菌株，涂布在固体缺陷培养基上培养，长出单克隆后，挑取单克隆，吹散置于灭菌的双蒸水中，然后再在检测培养基上培养并观察结果。

7.根据权利要求6所述的pGADT7-In载体的使用方法，其特征在于，所述检测培养基中含有浓度为5～15mM的3-Amino-1,2,4-triazole和40mg/L的X-α-Gal。