[发明专利]一种适用于In-Fusion克隆的pGADT7-In载体及其构建和使用方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于In‑Fusion克隆的pGADT7‑In载体及其构建和使用方法。本发明利用定点突变技术对pGADT7的多克隆位点进行改造获得pGADT7‑In载体，使pGBKT7和pGADT7‑In两个载体在被EcoRⅠ酶切后形成的末端含有长15bp以上相同的序列，进一步用In‑Fusion技术进行载体构建。构建一个给定的基因的诱饵载体或猎物载体只需一对引物，进行一次PCR。将得到的PCR产物和pGBKT7或pGADT7进行In‑Fusion反应，转化大肠杆菌，涂布不同抗性LB平板，用菌落或菌液PCR进行鉴定，很容易快速高效完成诱饵载体或猎物载体的构建。使用本发明的pGADT7‑In载体和构建载体的方法进行酵母双杂交载体构建，极大地缩短实验周期，降低实验成本，提高成功率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于In-Fusion克隆的pGADT7-In载体及其构建和使用方法。

背景技术

酵母双杂交是研究蛋白互作的最常用的方法，常常用于已知蛋白之间的互作验证和已知蛋白互作的蛋白的筛选。以常用的GAL4酵母双杂交系统为例，酵母双杂交技术包含两个载体，分别含有转录因子GAL4的激活结构域(AD)和转录因子GAL4的DNA结合结构域(BD)。使目的基因a和AD融合表达的载体称之为猎物载体，使目的基因b与BD融合表达的载体称之为诱饵载体。当目的基因a和目的基因b有相互作用时，GAL4的AD空间上接近BD，可以激活报告基因的表达，看到的结果是酵母在筛选培养基上生长和变蓝。

酵母双杂交实验的第一步，也是关键的一步，是酵母双杂交载体的构建。载体构建的传统方法是酶切和连接，包含对目的DNA片段和载体的切割回收以及后续两者的连接。该方法过程繁琐，实验周期长，且常常受制于载体和插入基因上的酶切位点，成功率不高。Gateway技术是Invitrogen已经商业化的技术，它是基于噬菌体的位点特异性重组反应，在目的片段添加重组位点，将PCR产物与含重组位点的供体载体混合进行BP反应获得入门载体(entry clone)，入门载体可以和不同用途的目标载体进行LR反应获得相应的表达载体，不依赖于酶切位点。有一些酵母双杂交载体通过改造可以利用Gateway技术进行载体构建。但是Gateway技术需要两步反应，而且起始PCR的引物需要包含30bp左右的attB位点，长的引物增加了PCR的难度和合成引物的成本以及引物合成中带来突变的概率，同时Gateway技术所用的酶比较贵。有研究者利用两轮PCR结合长引物的方法在目的基因两端融合attL的位点，绕过了BP反应，直接一步进行Gateway的LR反应进行载体构建，这种方法需要两轮PCR反应，增加了PCR的复杂性和突变的概率。

近些年发展起来的In-Fusion克隆技术是一种更为方便的载体构建技术，能够实现DNA片段无缝连接，完全不依赖于限制性内切酶和DNA连接酶，只需要最少15min就可以将DNA片段连接到任何载体中。In-Fusion克隆技术已经由Clontech公司开发出商业化的试剂盒，在相关酶的作用下，识别DNA片段和线性化载体末端不少于15bp的重组臂序列，进而将DNA片段整合入载体中。

发明内容

本发明克服了传统载体构建过程中需进行的酶切和连接的繁琐步骤及酶切位点的限制、Gateway技术需要较长引物起始和两轮反应耗时较长、改进后的Gateway技术需要两轮PCR的缺点。本发明首先利用定点突变技术(Site-directed mutagenesis)对猎物载体pGADT7的多克隆位点(Multiple Cloning Site,MCS)进行改造，提供了一种适用于In-Fusion克隆的pGADT7-In载体，所述pGADT7-In载体是由pGADT7载体定点突变获得，pGADT7-In载体和pGBKT7载体上多克隆位点中EcoRⅠ酶切位点的上下游具有一段长15bp以上的相同序列。

进一步地，所述pGADT7-In载体和pGBKT7载体上多克隆位点中EcoRⅠ酶切位点的下游具有一段长15bp的相同序列，该序列的正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ IDNO.2所示。