[发明专利]脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法

说明书

本发明公开了一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法。提取胎鼠大脑，分离皮层组织，消化处理；去除组织杂质，然后于第一培养液中制备细胞悬液；将细胞悬液接种于培养皿，置于细胞培养箱内培养，获得原代神经元培养液；原代神经元培养液中加入腺相关病毒进行神经元转染；转染后不断换液。本发明培养的原代神经元状态良好，转染方法稳定、高效、快速、可进行大基因片段转染。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒(Adeno-associated Virus，AAV)转染的方法。

背景技术

体外原代培养的皮层神经元在形态和生理特征上都与母体组织相似，能模拟体内环境，因此成为研究神经疾病机理、药物疗效、功能性基因改造等的重要实验模型。细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术，随着分子生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核生物的常规工具。因此，原代神经元的转染在神经领域的研究中至关重要，然而由于神经元是一种高度分化的细胞，动物出生后很少分裂，不同于其他细胞，神经元往往转染效率低并且难以存活。

目前对神经元转染的方式有脂质体转染、电穿孔转染和慢病毒转染。

脂质体转染指表面带正电荷的阳离子脂质体与和核酸的磷酸根通过静电作用形成DNA－脂复合体，通过膜的融合、细胞内吞或者直接渗透作用，使DNA传递进入细胞，再进一步在核内转录、表达。脂质体转染是应用最为广泛的转染方法之一，然而转染试剂细胞毒性高、转染效率低，使其难以在原代培养的神经元中得以应用。

电穿孔转染指利用高强度电场，瞬间提高细胞穿透性，从而导入外源DNA。但是强大电场引起的细胞毒性难以解决，并且外源基因无法整合到宿主基因组上导致不稳定表达，更需要特殊的电转仪器。

慢病毒转染指通过慢病毒载体将外源基因组合到宿主染色体上，达到稳定持久的表达目的，然而慢病毒所能携带的外源基因片段较小，低于8kb。

发明内容

因此为了解决上述技术存在的缺陷，本发明提出了一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法，采用了腺相关病毒，同时实现了稳定、高效、快速、大片段的原代神经元转染，满足神经科学研究的需求。

为实现上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤：

A)提取胎鼠大脑，分离皮层组织，消化处理；

B)去除组织杂质，然后于第一培养液中制备细胞悬液；

C)将细胞悬液接种于培养皿，置于细胞培养箱内培养，获得原代神经元培养液；

D)原代神经元培养液中加入腺相关病毒进行神经元转染；

E)转染后不断换液，以维持神经元生长所需的营养和适宜的环境。

所述步骤A)的皮层组织来自于怀孕第十八天SD大鼠胎鼠的大脑皮层。

所述步骤A)中分离皮层组织采用如下方法：腹腔麻醉孕鼠，取出胎鼠；用酒精消毒胎鼠表面之后断头，在无菌环境下用眼科镊剥开表皮和颅骨，取出全脑；用眼科镊分离大脑皮层，并在解剖显微镜下剥离血管膜。

所述步骤A)中消化处理采用如下方法：将剥离完血管膜的皮层组织用眼科镊剪碎；用0.25％的胰酶在37摄氏度的水浴锅中消化10～15分钟；最后加入胎牛血清(FetalBovine Serum,FBS)终止消化。

所述步骤A)中胎鼠断头之后到消化处理的用胰酶消化之前的操作均在冰浴的Hank’s平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution,HBSS)中进行。