[发明专利]脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法

权利要求书

1.一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

A)提取胎鼠大脑，分离皮层组织，消化处理；

B)去除组织杂质，然后于第一培养液中制备细胞悬液；

C)将细胞悬液接种于培养皿，置于细胞培养箱内培养，获得原代神经元培养液；

D)原代神经元培养液中加入腺相关病毒进行神经元转染；

E)转染后不断换液。

2.根据权利要求1所述的一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法，其特征在于：所述步骤A)的皮层组织来自于怀孕第十八天SD大鼠胎鼠的大脑皮层。

3.根据权利要求1所述的一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法，其特征在于：所述步骤B)中去除组织杂质制备细胞悬液具体方法为：吸出消化后的皮层组织沉淀用第一培养液轻轻吹打，静置取上清液；再一次加入第一培养液吹打沉淀，静止取上清；用过滤获得上清液，再于离心机中五分钟取沉淀；最后用第一培养液将沉淀吹打均匀，制备成细胞悬液。

4.根据权利要求1所述的一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法，其特征在于：所述步骤C)采用如下方法处理：直径为12mm的圆形玻片用浓硝酸浸泡处理10～24小时；吸去浓硝酸，用无菌水于摇床清洗5次，每次一小时；高压灭菌锅灭菌处理后烘干；在无菌的环境下，将玻片铺于培养皿中，加入0.1mg/ml的多聚L赖氨酸4度孵育10～14小时；吸去多聚赖氨酸，用灭菌水清洗三次，加入第一培养液，置于细胞培养箱中用细胞悬液进行接种。

5.根据权利要求1所述的一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法，其特征在于：所述步骤D)是在原代神经元培养液培养的第84～108小时加入腺相关病毒进行转染，每30万个左右神经元加入2～4ul腺相关病毒溶液，腺相关病毒滴度为2.82×10¹³v.g/ml。

6.根据权利要求1所述的一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法，其特征在于：所述步骤D)神经元转染具体采用以下方式：在原代神经元培养液培养的第84～108小时从培养皿中吸取200ul培养液与1～3ul腺相关病毒混匀，制成病毒悬液，再将病毒悬液加入回培养皿中，摇匀置于细胞培养箱培养。

7.根据权利要求1所述的一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法，其特征在于：所述步骤E)的第一次换液是在转染10～14小时后吸出原培养液，再加入第二培养液，并置于培养箱中培养。

8.根据权利要求1所述的一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法，其特征在于：所述步骤E)以每隔72～96小时半量换液的方法进行换液，用移液枪吸除一半容积的旧培养基，再加入一半容积的第一培养基。

9.根据权利要求7所述的一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法，其特征在于：所述第二培养液由第一培养液和保留培养液组成，体积比为1～2∶1；所述的保留培养液为原代神经元培养液培养的第84～108小时从培养皿中吸取的1ml培养液，保留培养液置于EP管中并且4摄氏度保存。

10.根据权利要求1或9所述的一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法，其特征在于：所述第一培养液由Neurobasal神经元培养基、双抗、Gluta MaxSupplement和B27组成，体积比为400～500∶3～5∶3～5∶10。