[发明专利]一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统

说明书

本发明公开了一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，由打靶载体和打靶供体两部分组成，其中，打靶供体携带需要引入的外源DNA片段，该外源DNA片段包括T2A小肽、荧光素酶基因cDNA序列、eGFP表达框、Neomycin基因序列和上、下游同源臂序列；打靶载体含有核酸酶Cas9表达框和靶向hDGKθ的引导链sgRNA表达框。该报告系统的建立方法，包括筛选靶向hDGKθ基因3′非编码区的sgRNA，构建携带Cas9、sgRNA表达元件的真核表达载体作为打靶载体，构建携带荧光素酶基因cDNA序列以及用于定点整合的上、下游同源臂和筛选基因的打靶供体，将这两种载体共同转染目标细胞，利用抗性基因筛选，即可完成靶向hDGKθ的荧光素酶报告系统在目标细胞中的建立。

本发明属于生物技术和药理学领域，涉及一种荧光素酶报告系统，特别涉及一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，可用于内源性人二酰甘油激酶(hDGKθ)表达活性的监测，也可用于对DGKθ产生调控作用的新药筛选。

背景技术

二酰甘油激酶(Diacylglycerol Kinases，DGKs)是重要的内源性脂类调节酶，能同时调控细胞内两种第二信使——DAG和PA的浓度，参与细胞内多种信号通路。DGKθ是DGKs同工酶第五型中的唯一亚型，也是DGK亚型中了解最少的之一。DGKθ最初在小鼠脑组织中被发现，在结构上含有三个富集的半胱氨酸区域(CRD),使它有别于其他亚型(含有两个CRD区域)。另外，其N末端具有脯氨酸/甘氨酸富集结构域，pleckstrin同源结构域(pleckstrinhomolog,PH)以及Ras相关结构域，C末端则是催化区域(catalytic domain)。这些功能结构域选择性和不同的效应物相互作用，并影响DGKθ的转录效率。

有研究表明，DGKθ可能涉及2型糖尿病、癌症、神经系统等多种疾病，是潜在的药物治疗靶点。建立一种报告系统，有效的对DGKθ基因的表达和调控进行监测，既可以研究其转录水平的调控机制，也可以靶向筛选活性药物，无疑具有重要意义。

目前，基于细胞转录激活检测的报告基因系统，是建立药物筛选模型的常用手段。传统报告基因系统一般通过体外克隆目标基因的启动子来驱动报告基因的表达。在细胞水平，报告基因相应启动子活性的变化，呈现出改变的荧光素酶活性，从而提供待测质粒和药物有效性的评估依据。但这种外源启动子活性的变化不能真实反映基因组的真实状态，因此难以准确反映基因组上基因表达情况。

基因编辑技术的发展，使得我们可以建立一种基于细胞内源性基因表达改变的新型报告系统，例如利用CRISPR/Cas9技术，将报告基因靶向性插入到目标基因下游，使报告基因的表达直接受内源靶基因启动子调控，能够真实反映细胞内真实的转录水平。根据申请人所进行的资料检索，到目前为止，尚没有发现针对靶向内源性DGKθ报告系统的相关报道，也没有关于DGKθ转录调控和新药筛选的文献资料可以参考。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，该报告系统同时携带Cas9和gRNA表达框的打靶载体，在转染时，使Cas9和sgRNA同时进入细胞，保证有效切割。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，其特征在于，该特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统由打靶载体和打靶供体两部分组成，其中：

所述打靶供体携带需要引入的外源DNA片段，该外源DNA片段是荧光素酶基因cDNA序列和位于其两侧的上、下游同源臂；

所述的打靶载体含有核酸酶Cas9表达框，同时还含有靶向hDGKθ的引导链sgRNA表达框。

根据本发明，所述的靶向hDGKθ的引导链sgRNA，其识别位点位于hDGKθ基因3′端，终止密码子的下游。

进一步地，所述的靶向是指将荧光素酶基因定点整合于hDGKθ基因组下游，使其受内源性DGKθ基因启动子的调控。