[发明专利]一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统

权利要求书

1.一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统的建立方法，其特征在于，按下列步骤进行：

(1)筛选靶向hDGKθ基因3′非编码区的sgRNA

从NCBI查找hDGKθ基因的基因组序列，在位于终止密码子之后的非编码区选择四个sgRNA结合位点并设计相应的sgRNA引物，将sgRNA引物退火后连接到Cas9表达载体，转染HEK293细胞，转染72小时后，提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，利用T7E1法筛选具有最高切割活性的sgRNA；

(2)构建携带Cas9和靶向hDGKθ基因的sgRNA的打靶载体

将筛选获得的靶向DGKθ基因的sgRNA表达元件、Cas9表达元件依次连入真核表达载体，获得pCas9-DGKθsgRNA；

(3)构建携带上下游同源臂及外源DNA片段的打靶供体

以人源化细胞基因组为模板，PCR扩增上、下游同源臂，依次连入携带T2A-LuciferasecDNA-CMV-eGFP-T2A-Neomyci-SV40pA元件的表达载体的两端；

(4)将打靶载体与打靶供体共同导入细胞，用筛选基因筛选，将筛选稳定后的细胞进行克隆化，对克隆化后的细胞克隆进行测序鉴定；

其中：所述的四个sgRNA结合位点分别为：

SgRNA1：CCCGCCCTCATCCCATTGGTGA，

SgRNA2：TGTTACCCCGTGTCCCGGGTGGG，

SgRNA3：TGATCTCACTTTGTGCCCCTCGG，和

SgRNA4:CTGGTGACTTCCTTGTGTTCAGG；

所述的上游同源臂的序列如下所示：

ACACCAGGTTTGAGAAGCCACGCATGGACGACGGGCTGCTGGAG GTTGTGGGCGTGACGGGCGTCGTGCACATGGTGAGCCGCCGGCCGAGTGGGCGGGCGAGCCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCAGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCTGGTCCCTGCTCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCAGCGGTGGGCGTCCCTGATCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCTGCGCTCCGGAATCCGGATTGCCCAGGGTTCCTACTTCCGAGTCACGCTCCTCAAGGCCACCCCGGTGCAGGTGGACGGGGAGCCCTGGGTCCAGGCCCCGGGGCACATGATCATCTCAGCTGCTGGCCCTAAGGTATGTGGGGTGAGGCTGGAGAGCCAGGGGAGGTGGGCCGGGCTGGGCCGGCCATGGGAGTGGCCAGTGGTACCCAGGTGGTGCTGGCATGGCCGGCTGCGGCCAGGGAGCACTGACTCCGGGAGGGTGCCTGCTTCAGAGGAGGGCTGTGCCAGTGGCCAGGCGGGCCACAGGTGGCACAGGGAGCAGCCAGACAGGTCCCTCCCCTTCCGTGAAATGGGGCTGAGATGGCATCAGCTGCCCGGGGCCCCAGGACCGGGGGCTGCCCGTGTACCGTTCTTTCATCGGCCATGTCACCCTGGTCCTCTGTCCCCTGCCCTGGGACAGGTGCACATGCTGAGGAAGGCCAAGCAGAAGCCGAGGAGGGCCGGGACCACCAGGGATGCCCGGGCGGATGCTGCGCCTGCCCCTGAGAGCGATCCTAGG；

所述下游同源臂的序列如下所示：

AGGCTAGGAGGTCTCAGGTGCTGCCCTGGCAGCACCAGAGTGTGGGCCGGGCCCGAGTGTCTGCCCCTCGGCCCTCAGGGTGGGGCACTTAGCACCCAGAAGGGACCAAAAGCAGGGCATGGCGGTGCAGAGGAGTTTGGGAGGTGTAAACAGCCCATGCACGTGGAGGAGGAGCTGGCTTTCAGCCCCAGACCCCACGCTAGCACTTTCCACGCTGCTTGCCCGCTGTTGATGT GCAGTTCCCAGTGCCTGTGTGAGCCGACATCTGCTCAGTCCTATCCCTCGTCAGCGTGTGGAGACCCAGCTCCTGCAGCCCTCCTGCTCCCACGCCCCCAGACAGCTTGGTGGAGGGTCCTGCATCTGGGCCAGGCTGGGGTGCACCCAGCCAAAGACAAAGCTGCCTCCACGTGCCCAAGGATTCAGATGGTGCACTGGCCCCGGGAGGAGTCTGACCAAAAATGGAGCCCGCTCTGTGGGGAAGCCCCGACTCCCCCACGAGAAACGGTCCCACGGTGCGGATCTCCCCCTTCCCTTGTGGGGCACAGCTGGCCTGGGCCTCCAATCCTGCGGAGCTTTCCTGGGTGTGGCTTTGACCTCAGAAGTGGCTCTGGTTTGGCCTCAGGAGTGTGGCCTGGCCCAGCCTGCTGCAGCCTCCTGGGGGGCCCTTGATGCCACTAATCCCCCGACCCCCCGCATCTGCCAAACTGCACAGACACACG；

利用所述建立方法构建的特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，荧光素酶基因可以被定点整合到hDGKθ基因下游，在自剪切小肽介导下，与hDGKθ基因同时受hDGKθ启动子转录起始，实现了荧光素酶活性与内源性靶基因hDGKθ活性直接相关；从而能够筛选对DGKθ基因具有转录调控作用的上游转录因子或者小分子药物；能促进hDGKθ在相关的神经系统性疾病及代谢性疾病治疗中作为潜在靶标的研究。