[发明专利]一种实现人的诱导多能干细胞来源的造血干祖细胞强效体内移植的方法

说明书

本发明涉及一种实现人的诱导多能干细胞来源的造血干祖细胞强效体内移植的方法，所述的方法通过MLL‑AF4单因子诱导。其优点表现在：本发明的方法简便、高效，能够诱导人的iPS细胞成为具有强效体内移植并重建多系造血的HSC，突破了该领域的诸多难点，并主要包括如下优点：(1)单个因子诱导，极大地减少了需要添加的因子数目，进而能显著地简化实验操作、提高实验效率；(2)采取质粒介导的诱导方法，避免了慢病毒介导时的基因组插入继而可能诱发基因突变的风险；(3)体内移植效率高达20％以上；(4)纠正了iPSC‑HSPC在体内的髓系偏倚现象，能在体内全面地重建髓系、淋系和红系。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种实现人的诱导多能干细胞来源的造血干祖细胞强效体内移植的方法。

背景技术

诱导多能干细胞(iPSC)技术是将已分化的体细胞重编程为多能干细胞，而多能干细胞能分化为所有器官、组织，因而是再生医学领域的一项重要变革，并于2012年获得了诺贝尔生理医学奖。造血干细胞(HSC)是唯一能够分化为全部血液细胞的成体干细胞，HSC在临床上有重要的应用和巨大的需求。然而HSC的来源却十分有限，主要包括骨髓的捐赠，但一方面，这种方法获得的HSC远远无法满足临床的需求，另一方面，骨髓配型的限制使得许多患者无法获得能够用于移植的HSC供体。自从2007年，人的iPSC能够在体外制备以来，利用iPSC在体外分化为可以重建体内造血的人的HSC成为了近10年来的研究热点，但同样是研究难点。

到目前为止，只有两篇报道成功地获得了人iPSC来源的具有体内移植能力的HSC，前者利用了五个由慢病毒介导的转录因子(ERG,HOXA9,RORA,SOX4,MYB)进行HSC分化的诱导，但是得到的HSC的移植能力低下，且在体内存在严重的髓系分化偏倚，几乎无法重建淋系造血，也无法维持到长程造血；后者则利用了七个转录因子(ERG,HOXA5,HOXA9,HOXA10,LCOR,RUNX1,SPI1)，同样由慢病毒介导，但是转染的目的细胞是经由iPSC体外分化得到的造血内皮细胞，因此该方法的效率十分低下。

目前，将人的iPSC分化为具有移植能力的HSC主要有如下瓶颈：(1)体外分化得到的造血细胞很难具有体内的重建全系造血能力；(2)iPSC来源的人的HSC在体内的造血常具有髓系分化偏倚，而淋系造血能力匮乏；(3)目前诱导人的iPSC分化为可移植的HSC的方法效率均十分低下，在受体(主要是免疫缺陷小鼠)体内几乎很难获得数量显著的人的血液细胞；(4)诱导造血分化的因子多为慢病毒载体所介导，且因子数目常多于或等于5个，使得病毒的转染量也相应增大，加大了病毒插入基因组导致基因突变的风险。

发明内容

本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供MLL-AF4的新用途。

本发明的第二个目的是，提供一种制备造血干祖细胞的方法。

本发明的第三个目的是，提供一种人工造血干祖细胞。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：MLL-AF4基因或蛋白在制备造血干祖细胞中的应用。

MLL-AF4基因或蛋白作为唯一转录因子在制备造血干祖细胞中的应用。

包含MLL-AF4基因或其片段的质粒在制备造血干祖细胞中的应用。

包含MLL-AF4基因或其片段的质粒的构建方法为：用肽段T2A进行MLL-AF4与EGFP的连接，通过PCR克隆出MLL-AF4-EGFP的片段，然后将MLL-AF4-T2A-EGFP片段插入到pTRE-Tight质粒中的TRE启动子下游，进而构建得到。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种由诱导多能干细胞制备造血干祖细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)诱导多能干细胞体外诱导分化为包含了造血干祖细胞的血液细胞；