[发明专利]一种实现人的诱导多能干细胞来源的造血干祖细胞强效体内移植的方法

权利要求书

1.一种由诱导多能干细胞制备造血干祖细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

（1）诱导多能干细胞体外诱导分化为包含了造血干祖细胞的血液细胞；

（2）步骤（1）得到的血液细胞经过包含 MLL-AF4 基因的质粒的体外诱导；

步骤（1）为单层培养法在体外将诱导多能干细胞诱导分化为血液细胞；

步骤（2）为步骤（1）得到血液细胞在培养液中培养，包含 MLL-AF4 基因的质粒和 CAG-rtTA 质粒按 照 3：1 的比例，进行电转，转染后的细胞继续在培养液中培养，同时添加 2ug/ml 的多西环素，维持 48~72 小时，然后利用 FACS 流式分选，将 GFP+ 、GFP- 的细胞分选出来，分别在含有2 ug/ml多西环素的培液中继续诱导培养5 ~ 7天， 然后再收集细胞进行一轮和二轮克隆形成试验；

步骤（2）中包含 MLL-AF4 基因的质粒通过如下方法制得：用肽段 T2A 进行 MLLAF4与 EGFP 的连接，通过 PCR 克隆出 MLL-AF4-EGFP 的片段，然后将 MLL-AF4-T2A-EGFP 片段插入到 pTRE-Tight 质粒中的 TRE 启动子下游，进而构建得到；步骤（2）中 所述的培养液由以下组分组成：StemSpan SFEM、100 ng/ml SCF、100 ng/mlTPO、100 ng/ml FLT3、20ng/ml IL-6、0.75μM SR1。