[发明专利]线粒体基因检测试剂盒及使用方法

说明书

本发明提供一种线粒体基因检测试剂盒及其使用方法，该线粒体基因检测试剂盒包括两组引物对、用于PCR扩增的试剂，以及用于sanger测序的试剂。本发明提供的线粒体基因检测试剂盒具有检测成本低、操作方便、灵敏度高、特异性高等特点，能广泛应用于个体识别、亲缘关系鉴定等法医学领域。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于sanger测序的线粒体基因检测试剂盒及使用方法。

背景技术

人类线粒体DNA 几乎存在于各种组织、细胞中,它是唯一分布于核外的人类遗传物质，具有自我复制、转录和编码的功能。线粒体DNA遵循母系遗传规律，即在排除突变的前提下, 同一母系的个体线粒体DNA 序列相同。因此现线粒体DNA检测越来越多的应用于法医领域，并展现出越来越重要的作用：（1）母系亲缘关系鉴定：是否来源于同一母系家族；（2）个体识别：在疑难、降解检材的同一性认定中发挥重要作用。

人类线粒体DNA（mt DNA）呈双链环状，总长度为 16569nt，分为编码区和控制区；控制区由1022bp (16024-16569bp及1-576bp) 组成。其中的16024-16365，73-340以及438-574bp三个区域为多态高发区，分别称为高变1区 (hypervariable region Ⅰ，HV Ⅰ)、高变2 区 (hypervariable regionⅡ，HV Ⅱ)和高变3 区(hypervariable region Ⅲ,HV Ⅲ)。这三个区域的高度多态性在不同个体和不同母系家族中存在高度差异性，对法医学个体识别及亲缘鉴定具有重要的意义。

为了将线粒体的上述特点应用到法医领域，现有多种线粒体基因测序方法，如申请号为201510863948.4的发明专利，提供了一种基于 sanger 测序人线粒体基因组的方法，此方法虽然避免了提取较高纯度 mtDNA 繁琐的实验操作过程，但是需要利用约二十组引物对在同一PCR反应条件下进行分段扩增，难以实现每一个片段都能被高品质地扩增出来，即难以实现扩增产物的单一性，所有者此专利中需要对每组扩增产物都进行琼脂糖凝胶电泳回收，如此，则大大增加了线粒体DNA扩增及回收的工作量。

申请号为201410482243.3的发明专利，提供一种基于二代测序技术实现对线粒体的全长进行测序，达到法医学中个体识别等目的。但此方法基于二代测序技术，不仅检测成本高，且灵敏度还有待提高（此专利中需要的模板量至少为5ng；血斑作为检测样本时，其直径不小于 1cm）。

因此，迫切希望开发一种操作简单、检测成本低、灵敏度高的线粒体基因检测试剂盒，使其能更广泛地应用于亲缘鉴定、个体识别等法医领域。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种线粒体基因检测试剂盒，包括两组引物对、用于PCR扩增的试剂，以及用于sanger测序的试剂。所述的两组引物对为：

第一组引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示的下游引物；第二组引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物。

用于PCR扩增的试剂具体包括：DNA聚合酶、dNTP和PCR反应缓冲液。

作为优化，上述的线粒体基因检测试剂盒还包括用于DNA提取的试剂，对头发、指甲、牙齿、血斑、口腔脱落细胞等检材进行人总DNA提取。

本发明的另一目的是提供上述线粒体基因检测试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：

S1、PCR扩增，获得包括线粒体控制区信息的两组基因片段：以人总DNA为模板，以第一组引物对为引物，经过PCR扩增后获得第一组基因片段；以人总DNA为模板，以第二组引物对为引物，经过PCR扩增后获得第二组基因片段；