[发明专利]高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法

权利要求书

1.一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

酶促反应以溶壁微球菌菌液为底物，用比浊法，将待测珍禽蛋蛋清样品溶液加入酶促反应体系，在445-455nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，根据待测珍禽蛋蛋清样品溶液中溶菌酶浓度，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位计算溶菌酶活力；

其中，采用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，得到菌液和珍禽蛋蛋清样品溶液。

2.按照权利要求1所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，采用0.06-0.08mol/L pH＝6.0-6.2的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，得到菌液和珍禽蛋蛋清样品溶液；

优选地，采用1/15-1/14mol/L pH＝6.0-6.2的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，得到菌液和珍禽蛋蛋清样品溶液。

3.按照权利要求1所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，在448-452nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，优选在450nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值。

4.按照权利要求1-3任一项所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，

待测珍禽蛋蛋清样品溶液中溶菌酶浓度为100-200μg/mL；

待测珍禽蛋蛋清样品用所述磷酸盐缓冲液稀释200-400倍，优选稀释200-300倍，进一步优选稀释250-300倍。

5.按照权利要求1-3任一项所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，将待测珍禽蛋蛋清样品溶液加入酶促反应体系前将溶壁微球菌菌液在445-455nm波长下的吸光度值调至0.45-0.77，优选0.55-0.75，进一步优选0.65-0.75。

6.按照权利要求1-3任一项所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)配制溶壁微球菌菌液：将溶壁微球菌于液体LB培养基中，37-38℃培养9-10h至菌体繁殖，将培养液离心，收集沉淀菌体，加入甘油溶液保存；使用前，用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌，得到溶壁微球菌菌液，并将菌液调至OD₄₅₀吸光度值至0.70±0.05，备用；

(b)配制试样溶液：取待测珍禽蛋蛋清样品用3-5层纱布过滤，取过滤试样，用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液稀释200-300倍，得到试样溶液；

(c)试样测定：先在281nm波长处测定试样溶液中溶菌酶浓度，再用比浊法，以溶壁微球菌菌液为底物，将试样溶液加入酶促反应体系，在450nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，根据试样溶液中溶菌酶浓度，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位计算溶菌酶活力。

7.按照权利要求6所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，步骤(c)包括以下步骤：先测定试样溶液中溶菌酶浓度c，再用比浊法，以所述磷酸盐缓冲液为空白液调零，将菌液置于1cm比色池中，每3mL菌液加入0.15mL试样溶液，从加入试样溶液开始计时，记录在450nm波长处反应间隔60s时间点的读数A₁、A₂，根据试样溶液中溶菌酶浓度c，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位，试样中溶菌酶活力按公式(1)计算：

式中：

E_A——溶菌酶活力，U/mg；

△E₄₅₀——在两时间点测定的吸光度A₁、A₂之差；

c——试样溶液中溶菌酶的浓度，μg/mL。