[发明专利]基于脂质体的囊泡分离效率评估和质控的方法

说明书

本发明提供一种基于脂质体的囊泡分离效率评估和质控的方法，先利用磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇酯等脂质，以及荧光染料来制备带有荧光的脂质体；将带有荧光的脂质体分别与血清、血浆及尿液样本混合后使用不同的分离方法，包括超速离心、膜亲和法、聚合物沉淀及色谱等方法进行囊泡分离；对分离得到的囊泡进行荧光测定。通过原始脂质体的荧光强度及分离得到的囊泡中的荧光强度即可计算不同方法囊泡的提取效率及不同临床样本处理过程中的提取效率。本发明利用荧光脂质体来评估囊泡的提取效率，为囊泡应用于临床需求的稳定质控体系提供了强有力的技术支持，同时提供了一种肉眼即可观察跟踪囊泡分离过程的有效方法。

技术领域

本发明涉及分析检验技术领域，具体地说，涉及一种基于脂质体的囊泡分离效率评估和质控的方法。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs；以下囊泡均代表细胞外囊泡)是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，直径从30-1000nm不等，胞外囊泡主要由微囊泡(MicroVesicles,MVs)和外泌体(exosomes)组成，微囊泡是细胞激活或损伤后从细胞膜脱落的小囊泡。由于细胞外囊泡独特的生物学特征，其在疾病诊断中有着重要的意义，特别是其中的外泌体。

外泌体是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合后分泌到细胞外环境中粒径介于30～150nm的膜性小囊泡，是细胞间信息传递的重要媒介，在抗原呈递、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤发生发展及转移过程中发挥了重要作用。其在体液中分布广泛，包括血液、唾液、尿液、乳汁和胸腹水等；包含DNA、RNA及蛋白质等多种内含物，可以作为肿瘤等多种疾病的无创诊断标志物。

囊泡分离是其应用的关键环节，根据囊泡的大小、密度及生物学特征，其主要的方法包括超速离心、梯度密度离心、聚合物沉淀、膜亲和、色谱法及免疫磁珠捕获等方法。基于这些基础原理，近些年囊泡分离的技术层出不穷，然而针对囊泡分离提取效率评估，特别是可以用于临床样本分离提取效率评估质控的方法并不成熟。目前主要利用Western Blot、NTA(或DLS)及电镜等方法对不同囊泡分离方法进行评估。这些方法要么费时要么需要特殊的设备，需求样本量大，操作繁琐且没法准确定量，无法有效用于临床样本囊泡分离效率的评估和质控。

发明内容

本发明的目的是提供一种带有荧光或有色染料的脂质体及其应用。

本发明的另一目的是提供一种基于脂质体的囊泡分离效率评估和质控的方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种带有荧光或有色染料的脂质体，所述带有荧光或有色染料的脂质体是将具有磷脂双分子层结构的脂质体与荧光染料或有色染料结合得到的。

本发明中，用于形成磷脂双分子层结构的脂质选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇及鞘磷脂等中的至少一种。

所述脂质体中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和胆固醇酯的摩尔比为5-8:1-3:1-3，优选7:1.5:1.5。

本发明所用荧光染料优选Fluorescein DHPE。此外还可以使用Fluorescein、Hydroxycoumarin、R-Phycoerythrin及FluorX等荧光染料，或用这些荧光染料修饰的脂质。

本发明提供的带有荧光或有色染料的脂质体中，所述荧光染料占脂质摩尔总量的1％～20％。

本发明提供的带有荧光或有色染料的脂质体粒径大小为30-1000nm(优选30-150nm)，平均密度为1.06-1.23g/mL。

本发明提供的带有荧光或有色染料的脂质体的直观图及鉴定结果如图1所示。其粒径大小、密度、电镜图像可以与囊泡一致，能够模拟囊泡的特征，其带有的荧光或有色染料可以利用检测荧光或吸收光的酶标仪进行检测。