[发明专利]粘红酵母的活菌生物胶囊在体内传递胰岛素的应用

说明书

本发明涉及一种粘红酵母的活菌生物胶囊在体内传递胰岛素的应用，同源重组法构建外源磷酸胞苷胆碱转移酶基因CCT整合表达载体，利用电穿孔技术将多肽转入GM4‑CCT胞内。本发明实现外源了CCT基因在粘红酵母GM4菌株内高表达，使重组菌株GM4‑CCT中的卵磷脂含量较野生菌株提高了1.5倍多；外源多肽被成功转入胞内，并且我们用insulin来验证此方法的可行性，发现insulin进入胞内的含量是初始量的1/2，且多肽成功被包裹进脂滴内；小鼠口服携带insulin的菌株GM4‑CCT‑insulin连续7天，发现小鼠血清和重要器官（肝、肺、脾、肾）中insulin的含量增加，在口服后2h时达到最高，其中肝脏浓度达到5.36，通过构建糖尿病小鼠动物模型，小鼠口服重组菌株GM4‑CCT‑insulin，与标准insulin相比，GM4‑CCT‑insulin作为外源性胰岛素具有显著的降血糖的作用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体是涉及一种粘红酵母的活菌生物胶囊在体内传递胰岛素的应用。

背景技术

磷脂（Phospholipid）是生物膜的基本成分，在生物膜中磷脂的亲水头位于膜表面，而疏水尾位于膜内侧，由于水是极性的，当众多的磷脂分子位于水溶液表面时，磷脂与水分子相互作用后通常会形成微团、脂质体、磷脂双层3种形式的磷脂分子复合物结构。多肽类药物都是生物大分子, 其共同特点是在生物体内不稳定,易于被蛋白水解酶降解, 因而在生物体内的半衰期较短,口服给药生物利用率低，且患者依从性差，因而限制了其广泛应用。而用脂质体包裹后, 可克服这些缺点。

真核生物体内其磷脂的合成其起始物为3-磷酸-甘油，3-磷酸-甘油在转酰基酶及磷脂酸酶作用下转变成二酰甘油，而二酰甘油在不同的转酰基酶的作用下合成不同的磷脂（图1）。因此，为控制磷脂的合成，可以通过提高转酰基酶的活性而使得磷脂的合成增多。胰岛素是由51个氨基酸组成的双链(A、B链)蛋白激素，分子量为5374，其是由胰岛β细胞所分泌的激素，通过作用于肝脏、肌肉和脂肪组织，同时调解糖原、脂肪、蛋白质的合成，以达到控制血糖的目的。

胰脏β细胞分泌的多肽类激素, 迄今为止仍为胰岛素依赖性糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus , IDDM)患者的首选药物。由于容易被胃肠道的蛋白水解酶降解, 故口服无效。因此目前临床上使用的胰岛素剂型仍以注射剂为主。当然，胰岛素作为一种外源性的药物来使用，在使用不当的情况下，可能会发生一些副作用，如低血糖反应、过敏反应、注射部位脂肪萎缩、体重增加、屈光不正等。为了尽量减少副作用以及注射使用的不便，增加了患者治疗的依从性。越来越多的制药企业加入到非注射胰岛素的研发大军中，口服、经鼻、经肺、经皮等给药系统开始被作为糖尿病研究热点，患者可以避免无休止的注射。

本实验室前期筛选到一株产脂能力较强的粘红酵母（Rhodotorula glutinis）GM4，其脂肪酸含量可以高达22.54%。并对筛选到的粘红酵母进行基因工程改造，即将脂质代谢的关键酶苹果酸酶ME转染到菌株体内使其高效表达，与野生菌相比，转化菌可以积累更多的脂质，通过气相色谱检测，其脂肪酸由棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸等组成。

因此，本实验中为提高粘红酵母GM4菌株体内磷脂的合成量，通过基因工程改造技术，即将磷脂合成的关键酶，尤其是卵磷脂合成的限速酶：磷酸胞苷胆碱转移酶（CCT）将其转染到菌株体内使其过表达，进一步提高菌株体内磷脂的合成，研究其作为药物活细胞脂质体的可能性。

发明内容

本发明目的是针对上述现有技术存在的不足，提供一种活菌生物胶囊及粘红酵母在体内传递insulin的应用。

为解决上述的技术问题，本发明采用如下技术方案：磷酸胞苷胆碱转移酶基因整合表达载体，将磷酸胞苷胆碱转移酶（CCT）整合到酵母菌的基因组。