[发明专利]一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体及重组产漆酶工程菌的构建方法

说明书

本发明公开了一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体及重组产漆酶工程菌的构建方法，以黄孢原毛平革菌为模板，利用同源克隆技术合成一个全长为1680bp的漆酶基因，核苷酸及氨基酸序列比对显示该漆酶基因与真菌漆酶基因有较高的同源性，将其命名为漆酶基因lac1680；根据漆酶基因lac1680的基因序列以及表达载体PET24a的MCS位点，将胶回收漆酶基因片段连接到经相同酶切线性化的表达载体上得到黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体，连接后的含有重组质粒载体的连接液转化大肠杆菌E.coli BL21，挑取阳性转化子，提取质粒酶切鉴定后测序，最终得到重组产漆酶工程菌。本发明构建的重组基因工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高，提高了近39%。

技术领域

本发明属于高产漆酶基因工程菌的构建技术领域，具体涉及一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体及重组产漆酶工程菌的构建方法。

背景技术

漆酶（laccase）是一种多铜氧化酶，能够对木质素进行有效的降解，氧化分解木质素中的酚类物质，近年来，对漆酶的研究也越来越多，并已经取得了显著的结果，在环境保护、造纸、食品等行业中也表现出极大的研究价值和应用潜力。尽管漆酶的研究已经取得一定的进展，但自然界中漆酶的产量较少，目前国内对产漆酶的菌种培养研究还处于起步阶段，因此利用分子生物学方法研究漆酶基因并制备表达漆酶的工程菌，对实现漆酶的大规模生产和漆酶在各行业应用具有重要的意义。漆酶在造纸、环保、能源及食品等领域极富利用价值，目前漆酶的发酵主要来自于真菌，但工业化生产却较难实现，究其原因主要是易污染、酶活性不稳定且活力相对较低所致。此外，大部分真菌漆酶只有在中温且弱酸条件下才能表现出较高的催化活性，这极大的限制了真菌漆酶在某些工业领域的应用。因此，通过克隆性质优良的新型漆酶基因，构建高效异源表达载体及蛋白质改造等，是解决漆酶资源短缺、增强酶在较高温度下的稳定性及在碱性条件下的高催化活性的重要途径。

黄孢原毛平革菌（phanerochaetechrysosporium）属于担子菌纲（Basidiomycetes），同担子菌亚纲（Homobasediomucetidas），非褶菌目（Aphyllophorales），丝核菌科（Corticiaceae）。由河南师范大学生命科学学院从菌肥中分离获得，该菌株具有高产漆酶的生化性质和生产性能。该菌株与报道过的其他菌株相比，酶活力高，降解性能较好，同时产酶的条件也好控制，为本研究漆酶基因的克隆表达、漆酶的纯化奠定了基础，对构建好的工程菌产生的漆酶进行了分离纯化和酶学性质研究，为后续运用蛋白质工程的方法改造酶的催化活力和稳定性奠定了基础。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体及重组产漆酶工程菌的构建方法，该方法利用同源克隆技术，将黄孢原毛平革菌的漆酶基因在工程菌中诱导表达，并对产生的漆酶进行纯化，通过对比重组基因工程菌与黄孢原毛平革菌野生株不通过培养时间产酶活力，构建的重组基因工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体的构建方法，其特征在于具体步骤为：

（1）以黄孢原毛平革菌phanerochaetechrysosporium为模板，利用同源克隆技术合成一个全长为1680bp的漆酶基因，核苷酸及氨基酸序列比对显示该漆酶基因与真菌漆酶基因有较高的同源性，将其命名为漆酶基因lac1680，该漆酶基因lac1680的基因序列如SEQ IDNo:1所示；