[发明专利]一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体及重组产漆酶工程菌的构建方法在审
| 申请号： | 201810037232.2 | 申请日： | 2018-01-15 |
| 公开（公告）号： | CN108018295A | 公开（公告）日： | 2018-05-11 |
| 发明（设计）人： | 陈建军;曹香林;刘梁涛;曹笑楠;曹宇 | 申请（专利权）人： | 河南师范大学 |
| 主分类号： | C12N15/53 | 分类号： | C12N15/53;C12N15/80;C12N1/15;C12R1/645 |
| 代理公司： | 新乡市平原智汇知识产权代理事务所(普通合伙) 41139 | 代理人： | 路宽 |
| 地址： | 453007 河*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 原毛 平革菌漆酶 基因 重组 质粒 载体 产漆酶 工程 构建 方法 | ||
1.一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体的构建方法，其特征在于具体步骤为：
（1）以黄孢原毛平革菌phanerochaetechrysosporium为模板，利用同源克隆技术合成一个全长为1680bp的漆酶基因，核苷酸及氨基酸序列比对显示该漆酶基因与真菌漆酶基因有较高的同源性，将其命名为漆酶基因lac1680，该漆酶基因lac1680的基因序列如SEQ IDNo:1所示；
（2）根据漆酶基因lac1680的基因序列以及表达载体PET24a的MCS位点，设计以下两条特异性引物：Lac-F1：5’ CATATCCATATGCTGTTTGCCCTGCTGGCCCTG 3’，其基因序列如SEQ IDNo:2所示，Lac-R1：5’ AATCACCTCGAGTGCGGCGCTG CACATATTTG 3’，其基因序列如SEQ IDNo:3所示，其中F1中含有Nde I酶切位点，R1中含有Xho I酶切位点，以漆酶基因lac1680为模板，F1、R1为引物进行PCR扩增，扩增产物回收后，与对应表达载体经双酶切、回收、连接，最终将胶回收漆酶基因片段连接到经相同酶切线性化的表达载体上得到黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体。
2.根据权利要求1所述的黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体的构建方法，其特征在于步骤（2）中PCR扩增条件优选为：94℃，5min预变性；94℃，1min，58℃，30s，72℃，2min；29个循环；72℃延伸10min。
3. 一种重组产漆酶工程菌的构建方法，其特征在于具体步骤为：将权利要求1中步骤（2）连接后的含有重组质粒载体的连接液转化大肠杆菌E.coli BL21，挑取阳性转化子，提取质粒酶切鉴定后测序，最终得到重组产漆酶工程菌，该重组产漆酶工程菌产酶活力明显高于黄孢原毛平革菌野生株产酶活力。
4. 根据权利要求3所述的重组产漆酶工程菌的构建方法，其特征在于：所制得的重组产漆酶基因工程菌漆酶诱导表达的最佳条件为：使用0.4-0.6mmol/L IPTG，25℃ 200-250rpm诱导≥5h，经对重组产漆酶工程菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE检测，获得75KDa目的条带，表明诱导表达成功。
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