[发明专利]一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

说明书

本发明提供一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于微生物基因工程技术领域。本发明将密码子优化后的水蛭透明质酸酶基因前端添加谷氨酸棒杆菌信号肽后构建重组质粒，将该质粒电转入谷氨酸棒杆菌中获得能高效分泌表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌，发酵液中透明质酸酶的酶活达12000U/ml。本发明利用该重组谷氨酸棒杆菌发酵产生的透明质酸酶可以在温和的条件下将高分子量透明质酸高效酶解成低分子量的透明质酸，从而精确控制所需的分子量，且生产过程没有明显的污染，能耗小，成本低，适于规模化生产小分子量透明质酸，具有重要的工业应用前景。

技术领域

本发明属于微生物基因工程和发酵工程技术领域，具体地说，涉及一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其在生产小分子量透明质酸中的应用。

背景技术

透明质酸是D-葡萄糖醛酸及N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,3及β-1,4糖苷键连接而成的高分子多糖类物质，又称玻尿酸。透明质酸广泛地存在于人体的各个部位，具有极其重要的生理作用，如协助水电解质的扩散转运，润滑关节，调节血管壁的通透性，促进伤口愈合等。另外，透明质酸具有极强的保湿作用，被称为理想的天然保湿因子。它是目前自然界中发现的化妆品用保湿性能最好的物质。透明质酸具有不同的分子量，其分布从几千到几百万道尔顿，因其分子量的不同，其性能及应用也有所不同。小分子量的透明质酸(分子量10万)能渗入真皮，容易被人体吸收，因此主要作于保健食品，美容食品及药物载体领域；中分子量的透明质酸(10万分子量100万)能够紧致肌肤，因此在保湿、面膜、化妆品领域具有广泛应用；大分子的透明质酸(分子量100万)，可以作为皮肤填充剂，在美容、医药领域具有广泛的应用。目前全球透明质酸的市场已经超过100亿美元。

目前小分子量透明质酸的生产方法主要是通过机械破碎法或者化学法，能耗和污染较大，且透明质酸的分子量难以控制，不适用规模化生产小分子量透明质酸。

发明内容

本发明目的是提供一种能够表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其在生产小分子量透明质酸中的应用。

本发明提供的表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌含有透明质酸酶基因。

所述透明质酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述透明质酸酶基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，本发明的重组谷氨酸棒杆菌，通过以下步骤构建得到：以SEQ ID NO.2所示的基因为模板，以SEQ ID NO.3-4所示序列为引物进行PCR，扩增获得约1.6kb的hya片段，将该片段酶切后与载体进行连接，获得的重组质粒，将该质粒电转入谷氨酸棒杆菌即得重组谷氨酸棒杆菌。

在本发明的实施例中，是将得到的hya片段用SalI/EcoRI进行双酶切，并与同样进行SalI/EcoRI双酶切的pEC-H36进行连接，获得的重组质粒命名为pEC-hya，将该质粒电转入谷氨酸棒杆菌即得重组谷氨酸棒杆菌。电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。

本发明提供了上述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产透明质酸酶中的应用。