[发明专利]一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

权利要求书

1.一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，该重组谷氨酸棒杆菌含有透明质酸酶基因,所述透明质酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其通过以下步骤构建得到：以SEQ ID NO.2所示的基因为模板，以SEQ ID NO.3-4所示序列为引物进行PCR，扩增获得约1.6kb的hya片段，将该片段酶切后与载体进行连接，获得的重组质粒，将该质粒电转入谷氨酸棒杆菌即得重组谷氨酸棒杆菌。

3.权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产透明质酸酶中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将重组谷氨酸棒杆菌接种于发酵培养基中，发酵培养；所述发酵培养基1升配方为：1-3g/L of K₂HPO₄,1-3g/L KH₂PO₄,1-5g/L尿素,5-30g/L(NH₄)₂SO₄,0.5-2.5g/L MgSO₄,100-500μg/L生物素,1-5mg/L的维生素B1,5-20mg/L的泛酸钙,5-20mg/L的FeSO₄,1-5mg/L的MnSO₄,1-10mg/L的ZnSO₄,100-500μg/L的CuSO₄,5-20mg/L的CaCl₂,1-10g/L的酵母粉,1-10g/L的酪蛋白水解物，25-20mg/L的卡那霉素。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，发酵过程温度控制在28-33℃，溶氧控制在30％以上，pH控制在6.0-7.0，发酵过程流加葡萄糖使得发酵罐中葡萄糖浓度维持在5-10g/L，发酵周期36-48h。

6.一种生产小分子量透明质酸的方法，其特征在于，在大分子量的透明质酸溶液中加入权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌的发酵上清液，通过控制反应时间，制备所需小分子量的透明质酸。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，大分子量的透明质酸溶液的浓度为20-50g/L，并加入1-5倍体积发酵上清液，30-37℃放置6-24h，制得小分子量的透明质酸。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述发酵上清液是将重组谷氨酸棒杆菌接种于发酵培养基中，发酵培养得到；所述发酵培养基1升配方为：1-3g/L of K₂HPO₄,1-3g/L KH₂PO₄,1-5g/L尿素,5-30g/L(NH₄)₂SO₄,0.5-2.5g/L MgSO₄,100-500μg/L生物素,1-5mg/L的维生素B1，5-20mg/L的泛酸钙,5-20mg/L的FeSO₄,1-5mg/L的MnSO₄,1-10mg/L的ZnSO₄,100-500μg/L的CuSO₄,5-20mg/L的CaCl₂,1-10g/L的酵母粉,1-10g/L的酪蛋白水解物，25-20mg/L的卡那霉素。