[发明专利]一种基于CRISPRi的共利用葡萄糖和木糖生产N-乙酰氨糖的方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPRi的共利用葡萄糖和木糖生产N‑乙酰氨糖的方法，属于遗传工程领域。本发明以枯草芽孢杆菌BSGNY‑P_veg‑glmS‑P₄₃‑GNA1为出发菌株，在基因组上整合了受木糖诱导的dCas9以及三个可分别作用于zwf，pfkA和glmM三个基因的sgRNA表达片段，并利用该菌株在摇瓶发酵，使N‑乙酰氨基葡萄糖产量达到20.5g/L，N‑乙酰氨基葡萄糖得率为0.612g/g葡萄糖，同时实现了重组枯草芽孢杆菌对于葡糖糖和木糖的高效共利用，并为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖及其工业化奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种基于CRISPRi的共利用葡萄糖和木糖生产N-乙酰氨糖的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。然而，重组枯草芽孢杆菌(BSGNY-P_veg-glmS-P₄₃-GNA1)的产量与产物转化率尚不能满足工业化的要求，因此还需进一步提高重组枯草芽孢杆菌的生产能力。葡糖糖进入细胞之后会进入到糖酵解途径及磷酸戊糖途径，同时肽聚糖的合成也会利用一部分葡萄糖，想要进一步提高乙酰氨基葡萄糖的产量与得率必须减弱葡萄糖去往这些途径的流量。但是这些途径对于细胞生长都发挥着极其重要的作用，直接将其阻断势必会影响到细胞的生长，因此需要对这些途径进行动态的调控，以达到细胞生长与产物合成之间的平衡。同时，木糖作为木质纤维素水解的主要产物，是除葡萄糖以外自然界中最丰富的糖分，但是多数微生物对的其利用能力较弱，葡萄糖与木糖的共利用也存在很大的问题，若能构建一株可以同时高效利用葡萄糖与木糖的生产菌株，便可以使其利用可再生的生物质资源进行目的产物的合成。现有技术中在枯草芽孢杆菌中实现葡萄糖与木糖的共利用是通过解除木糖代谢的调控实现的，即在枯草芽孢杆菌中强化表达其转运蛋白araE并表达来自于大肠杆菌的木糖代谢途径基因xylAB(参考文献：CHEN T等.Engineering Bacillus subtilis for acetoinproduction from glucose and xylose mixtures[J].Journal of Biotechnology,Elsevier B.V.,2013,168(4):499–505.)。然而现有技术只是强化了木糖的代谢途径，并未对葡萄糖的代谢进行调控，而当细胞可以同时利用葡萄糖和木糖时，可以将更多的葡萄糖引入到目标产物的合成途径中去，以避免碳源的浪费。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于CRISPRi的高效共利用葡萄糖和木糖生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

本发明的第一个目的是提供一种能够高效共利用葡萄糖和木糖生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，所述基因工程菌利用dCas9蛋白和sgRNA调控糖酵解、磷酸戊糖及肽聚糖合成三条途径。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌整合表达了dCas9蛋白，同时整合了三个可分别作用于zwf，pfkA与glmM三个基因的sgRNA表达片段。