[发明专利]一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法

说明书

本发明提供了一种利用根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法，属于基因的遗传转化技术领域，包括以下步骤：1)质粒载体改造；2)改造后的质粒载体转化农杆菌，获得阳性菌；3)阳性菌侵染平菇菌丝，共培养得新长出的菌丝；4)将所述新长出的菌丝接种到含有潮霉素和头孢霉素的PDA培养基上选择培养5～7d，分离得到有抗生素抗性的平菇转化菌株；5)对所述平菇转化菌株进行转基因鉴定。本发明方法适用于平菇基因功能的验证及遗传改良育种等研究，具有操作简单、稳定性强、转化率高、成本低廉等优点。

技术领域

本发明属于基因的遗传转化技术领域，具体涉及一种根癌农杆菌介导的 平菇遗传转化方法。

背景技术

平菇(Pleurotus ostreatus)又名糙皮侧耳，隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌 目、白菇科、侧耳属，是白腐菌最为常见的一种。平菇其味道鲜美，营养丰 富，而且还有较高的医疗保健价值，因而是当前我国广泛栽培的食用菌之一。

食用菌的遗传转化技术是运用分子生物学和基因工程等方法将外源基因 片段插入到受体食用菌基因组，通过复制、转录、翻译以达到定向改变受体 菌株生理生化。目前，较为常用的食用菌遗传转化方法有：聚乙二醇(PEG) 介导转化法、农杆菌介导转化法(ATMT)、电激转化法及基因枪转化法等。 相较于PEG法和电激转化法的转化率底，重复性差；基因枪法的昂贵，农杆 菌介导转化法(ATMT)法具有重复性高、方便操作，转化效率高，费用少等 特点。同时，农杆菌介导法可以以菌丝体作为受体材料，避免了以原生质体 为受体材料存在的制备及再生困难等缺点，在实践应用方面具简化操作的作 用。

1998年De Groot等首次用农杆菌转化法成功转化多种丝状真菌。但是不 同的真菌转化工艺存在差异，这就易造成转化复杂，结果不稳定性、重复性 差等问题。目前并没有一种平菇的高效转化方法的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传 转化方法，建立简化、稳定性强、成本低、高效的根癌农杆菌介导的平菇遗 传转化技术，为平菇基因功能的验证及遗传改良育提供技术支撑。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法，包括以下 步骤：

1)将转染用质粒载体的启动子改造为平菇同源启动子，获得改造后的质 粒载体；所述转染用质粒载体为含有两个CaMV35S启动子的质粒载体；

2)将步骤1)得到的所述改造后的质粒载体转化入根癌农杆菌感受态中， 培养1～3d，获得阳性菌；

3)将步骤2)得到的所述阳性菌侵染平菇菌丝，共培养2～4d，得新长出 的菌丝；

4)将步骤3)得到的所述新长出的菌丝接种到含有潮霉素和头孢霉素的 PDA培养基上选择培养5～7d，分离得到有抗生素抗性的平菇转化菌株。

优选的，步骤1)所述改造为将质粒载体的两个CaMV35S启动子改造为 平菇同源sdi和gpd启动子。

优选的，步骤1)所述改造的步骤包括：

a.质粒载体双酶切切除第一CaMV35启动子区，设计带有酶切位点的引 物；

b.利用步骤a所述引物克隆扩增平菇sdi的启动子基因片段；

c.连接步骤a双酶切后的质粒载体与步骤b得到的sdi启动子基因片段， 构建质粒载体-SDI质粒；

d.将步骤c构建成功的质粒载体-SDI质粒双酶切，切除第二CaMV35启 动子区，根据切除第二CaMV35启动子区后的质粒载体-SDI质粒设计引物；

e.利用步骤d所述引物克隆扩增平菇gpd的启动子基因片段，