[发明专利]一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法

权利要求书

1.一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法，包括以下步骤：

1)将转染用质粒载体的启动子改造为平菇同源启动子，获得改造质粒载体；所述转染用质粒载体为含有两个CaMV35S启动子的质粒载体；

2)将步骤1)得到的所述改造质粒载体转化入根癌农杆菌感受态中，培养1～3d，获得阳性菌；

3)将步骤2)得到的所述阳性菌侵染平菇菌丝，共培养2～4d，得新长出的菌丝；

4)将步骤3)得到的所述新长出的菌丝接种到含有潮霉素和头孢霉素的PDA培养基上选择培养5～7d，分离得到有抗生素抗性的平菇转化菌株。

2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤1)所述改造为将两个CaMV35S启动子改造为平菇同源sdi和gpd启动子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述改造的步骤包括：

a.质粒载体双酶切切除第一CaMV35启动子区，设计带有酶切位点的引物；

b.利用步骤a所述引物克隆扩增平菇sdi的启动子基因片段；

c.连接步骤a双酶切后的质粒载体与步骤b得到的sdi启动子基因片段，构建质粒载体-SDI质粒；

d.将步骤c构建成功的质粒载体-SDI质粒双酶切，切除第二CaMV35启动子区，根据切除第二CaMV35启动子区后的质粒载体-SDI质粒设计引物；

e.利用步骤d所述引物克隆扩增平菇gpd的启动子基因片段；

f.连接步骤d所述双酶切后的质粒载体-SDI载体与步骤e得到的所述gpd启动子基因片段，得到改造后的质粒载体。

4.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤2)所述培养为暗培养。

5.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤3)所述平菇菌丝为菌丝球。

6.根据权利要求5所述的遗传转化方法，其特征在于，所述菌丝球的制备方法包括：将平菇菌丝体的菌块置于PDA液体培养基上接种培养3～4d。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述接种培养的条件包括恒温摇床，160～200r/min，22～28℃下避光培养。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述共培养用培养基为含有终浓度为200μmol/L的乙酰丁香酮的PDA培养基，所述共培养的条件包括：22～28℃下避光培养。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述选择培养的条件包括：22～28℃下暗培养。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)得到所述平菇转化菌株后还包括转基因鉴定。