[发明专利]一种高产胞外多糖菌株及其多糖分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种高产胞外多糖菌株及其多糖分离纯化方法。该菌株命名为柠檬明串珠菌(Leuconstoc citreum)B‑2，于2017年12月04日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15014。本发明从菠萝自然发酵液中分离筛选出一株高产胞外多糖的乳酸菌，经鉴定为柠檬明串珠菌(Leuconstoc citreum)。将柠檬明串珠菌(Leuconstoc citreum)B‑2接种于产糖发酵培养基中培养得到发酵液，离心去除菌体，用乙醇沉淀，获得粗多糖；将粗多糖进行纯化，即得胞外多糖。经结构性质测定，该多糖为葡聚糖，呈高度分支结构。这种纯化方法纯度好、产糖量高、操作简便。本发明用于产胞外多糖。本发明技术方案拓展了产胞外多糖的微生物菌种来源，并提供了一种乳酸菌产胞外多糖纯化的新方法。

技术领域

本发明涉及一种高产胞外多糖菌株及其多糖分离纯化方法。

背景技术

胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是微生物(如细菌、酵母、真菌)在生长过程中分泌到细胞外的粘液或荚膜多糖。在众多产胞外多糖的微生物中，乳酸菌(lactic acidbacteria,LAB)具有发酵周期短、营养要求简单等优越性，成为微生物胞外多糖的理想来源。乳酸菌胞外多糖已作为稳定剂、增稠剂被用于酸奶、奶酪等发酵奶制品的生产中。此外，乳酸菌胞外多糖还有降低胆固醇、抗氧化、抗肿瘤、对消化道的调节等作用。与其他多糖相比，乳酸菌胞外多糖的研究更具有实际价值，乳酸菌生长极为迅速，它的胞外多糖提取工艺更简单，安全性较高、价格便宜，比其他微生物多糖更适用于人类。因此，挖掘自然界中丰富的乳酸菌资源，发现高产胞外多糖的乳酸菌细菌菌株，以短周期、低成本获得更多的胞外多糖，一直是微生物学领域的研究热点。

此前，有研究者为得到纯的胞外多糖，采用固体培养基，直接从培养基表面提取胞外多糖，此法对操作者要求高，且培养基不能被充分利用，产糖量很低，造成成本浪费。

发明内容

本发明的目的是为了拓展产胞外多糖的微生物菌种来源，提供一种乳酸菌胞外多糖的分离纯化新方法。

所述胞外多糖菌株为柠檬明串珠菌(Leuconstoc citreum)B-2，已于2017年12月04日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.15014。该菌株经16S rRNA基因测序的结果见序列表SEQ ID NO:1。

所述高产胞外多糖菌株为革兰氏阳性细菌，不产芽孢和鞭毛，兼性厌氧，能以多种糖类为碳源进行乳酸发酵。菌落为圆形，不透明，灰白色，边缘整齐，略突起，正反面颜色一致，中央与边缘颜色一致。发酵葡萄糖产酸产气，接触酶阴性，不水解精氨酸，不产吲哚。微生物生理生化试验说明具有明串株菌属(Leuconostoc)的特性。

本发明胞外多糖分离纯化方法，按以下步骤进行：

1)将柠檬明串珠菌(Leuconstoc citreum)B-2接种于产糖发酵培养基中培养得到发酵液。将发酵液进行低温高速离心，去除菌体，取上清。

2)将离心去除菌体后的上清用乙醇沉淀，静置，离心，取沉淀。

3)将沉淀溶解于蒸馏水中，在溶液中加入三氯乙酸溶液以沉淀蛋白质，连续搅拌，离心，取上清液。

4)将上清液用乙醇沉淀，静置，离心，取沉淀。

5)将沉淀再溶解于蒸馏水中，进行透析，得到粗多糖溶液。

6)将粗多糖进行凝胶柱层析，得到纯胞外多糖。

在步骤1)中，所述离心温度为4℃，离心时间为30～40min，离心转速为4000rpm。