[发明专利]一种催化活性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体

说明书

本发明公开了一种催化活性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。本发明的突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将第106位的缬氨酸突变成了异亮氨酸。本发明摇瓶诱导10h得到的突变酶PvEH1^V106I催化活性为234.75U/g，是野生型酶(157.15U/g)的1.49倍。

技术领域

本发明涉及一种催化活性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。

背景技术

环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)广泛存在于动物、植物、微生物等自然环境中，它能够通过添加一分子水到环氧环上使得环氧化物开环水解形成相应的二醇，此过程无需辅因子以及金属离子的参与。由于环氧化物水解酶在催化水解时具有高立体选择性、反应条件温和及对环境污染小等特点，近年来人们越来越重视它在生物催化水解外消旋环氧化物的应用价值。

绝大多数的EHs按照催化机理的不同可分为三类：一是柠檬烯-1,2-环氧化物水解酶家族，代表为R.erythropLis EH(EC 3.3.2.8)；二是白三烯A₄水解酶；三是α/β-折叠环氧化物水解酶家族。目前研究最多的为α/β-折叠环氧化物水解酶家族。随着结构生物学的迅速发展，己有多种环氧化物水解酶的结构得到解析，如：放射性土壤杆菌环氧化物水解酶Agrobacterium radiobacter AD1 EH(ArEH)，黑曲霉环氧化物水解酶Aspergillus nigerEH(AnEH)，人环氧化物水解酶Homo sapiens sEH(HssEH)，鼠环氧化物水解酶Mus msculusshe(MmsEH)，结核分枝杆菌环氧化物水解酶Mycobacterium tuberculosis EHA(MtEHA)，以及来自土豆环氧化物水解酶Solanum tuberosum EH(StEH)等。

α/β-折叠环氧化物水解酶家族的催化机制通常分为两步：1)两个酪氨酸残基通过氨键接合环氧底物环氧乙烷上的氧原子，然后环氧化物水解酶上的天冬氨酸残基亲核攻击环氧环上其中一个碳原子，形成二元醇－酯－酶共价结合的二聚体；2)一分子的水由于受到Asp/Glu-His残基的活化产生一个烃基，从而攻击之前形成的共价二聚体，释放出邻位二醇产物，亲核试剂得重生。

虽然近年来环氧化物水解酶由于其反应时无需辅因子或金属离子的参与、反应条件温和、对环境友好等优点在制备光学纯的底物和产物上受到广泛重视，但是在实验室和工业规模的应用上，环氧化物水解酶因其酶活较低等缺陷限制了其进一步的发展。蛋白质工程的优势在于能够在一定程度上克服以上一系列的缺点。

发明内容

本发明要解决的第一个问题是提供一种催化活性提高的环氧化物水解酶(PvEH1)突变体。

所述突变体是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)在严格条件下与(a)限定的氨基酸序列杂交且编码具有环氧化物水解酶活性的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体的基因的核苷酸序列是SEQ IDNO.3所示的序列。

本发明还提供获得所述突变体的方法，是在如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基础上，将第106位的缬氨酸突变成了异亮氨酸(V106I)。

在本发明的一种实施方式中，以携带编码环氧化物水解酶的基因PvEH1的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主；培养宿主使之产环氧化物水解酶突变体。