[发明专利]一种提高AA-2G产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

说明书

本发明公开了一种提高AA‑2G产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明通过环糊精葡萄糖基转移酶进行突变，得到的突变体生产AA‑2G产量较野生酶有了明显的提高，且本发明得到的环糊精葡萄糖基转移酶突变体产量高，纯化简单，适于工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种提高AA-2G产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

维生素C(VC)是一种人体自身不能合成的水溶性维生素，参与体内很多的生理活动，如促进胆固醇转变为胆汁酸，促进肾上腺皮质激素的合成，参与芳香氨基酸的代谢，促进铁的吸收及参与体内多种氧化还原反应，在维持和促进人体健康中扮演着重要的角色。另外，维生素C还能促进胶原蛋白的合成，还原已形成的黑色素，对保持皮肤弹性、美白、除皱有一定的作用。广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。但是VC二位碳的羟基极不稳定，非常容易氧化降解而限制了其应用。2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)是一种维生素C的糖类衍生物，是最稳定、性能最佳的VC替代品，近些年主要作为一种美白添加剂应用于多种品牌的高端化妆品中。

目前，AA-2G主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶是最常用的催化酶。现有技术针对环糊精葡萄糖基转移酶的基因改造和高效表达研究较多，但是实现环糊精葡萄糖基转移酶在工业化生产中仍存在很大的问题，例如酶产量较低，酶催化制备 AA-2G的转化率低等。CGTase具有以分子间转糖基反应制备特定产物的优良应用性能，其受体分子具有广谱性，但针对不同受体，获得的转化率差异很大，通常以糖类分子作为天然受体分子，其转化率明显高于非糖类分子，如本研究中的VC，并且以非糖分子做受体的产量难以提高。此外，CGTase催化合成AA-2G的过程中,α-和β-环糊精具有相对较高的转化率，常被用作糖基供体。然而，α-环糊精价格昂贵，β-环糊精很难溶于水，所以从生产成本考虑，两者均不适合大规模生产AA-2G。因此，以价廉易得的淀粉或麦芽糊精为糖基供体，通过分子改造CGTase技术提高VC作为受体的底物特异性，将推动L-AA糖基衍生物相关行业的快速发展。

发明内容

发明所要解决的一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的一个或多个氨基酸位点进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体的产量有所提高。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第228位的赖氨酸(Lys)、230位的甲硫氨酸(Met)、262位的天冬氨酸 (Asp)中的一个或者多个位点进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第230位的甲硫氨酸(M)突变为亮氨酸，命名为M230L。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第262位的天冬氨酸(D)突变为精氨酸，命名为D262R。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第230位的甲硫氨酸(M)突变为亮氨酸，同时将第262位的天冬氨酸(D)突变为精氨酸，命名为M230L/D262R。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第228位的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)，同时将第230位的甲硫氨酸(M) 突变为亮氨酸，第262位的天冬氨酸(D)突变为精氨酸，命名为K228R/M230L/D262R。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体的制备方法，包括如下步骤：