[发明专利]一种催化活性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种催化活性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体及其应用，属于基因工程和蛋白质表达领域。本发明的突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将第196位的亮氨酸突变成了天冬氨酸。本发明摇瓶诱导10h得到的突变酶PvEH1^L196D催化活性为69.92U/g，是野生型酶(49.53U/g)的1.41倍。

技术领域

本发明涉及一种催化活性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体及其应用，属于基因工程和蛋白质表达领域。

背景技术

手性环氧化物和邻二醇是合成手性药物、农业、香料及精细化工等行业各种活性物质的中药中间体，具有广阔的应用前景和市场需要求。光活性的手性化合物具有不同于外消旋体的独特性质，其在生物体内的代谢途径、代谢速率、药理以及毒性等方面的差异，时期在化学和生命科学产业有着崭新和特殊的用途。20世纪60年代，震惊世界的“反应停事件”已经充分说明获得光学纯化合物的必要性。传统的化学拆分环氧化物往往需要重金属类毒物质作为催化剂，不仅面临着环境的巨大挑战，且很难获得高产率的手性纯化合物。

环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)能够催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。是一种典型的α/β折叠型水解酶。EHs具有反应时不需要金属离子和辅酶、来源广泛、对映选择性高等优点，成为一种非常有潜力的生物催化剂，具有较高的研究价值。然而，不同来源的EHs的性质均存在着很大的差异，自然界筛选到的EHs往往存在酶活低、立体选择性低一级稳定性差等缺陷，万万不能满足工业化应用的要求。另外，底物为水不溶性有机化合物易自发水解，且不利于酶的催化反应，存在底物/产物抑制作用的等不利因素，限制了他们在工业生产中广泛和有效的应用。如何不断将EHs改造和筛选出比酶活高、立体选择性强、极端环境耐受性好的优良酶，并且有效的应用于工业生产中，已称为现在面临的最大挑战。

从菜豆(Phaseolus vulgaris)克隆了一种环氧化物水解酶(PvEH1)，并实现其在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中异源表达。通过同源建模分析该酶的蛋白质结构，并通过定点突变技术对PvEH1进行分子改造，提高其酶活，具有较强的工业化应用价值。

发明内容

本发明要解决的第一个问题是提供一种催化活性提高的环氧化物水解酶(PvEH1)突变体。

所述突变体是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)在严格条件下与(a)限定的氨基酸序列杂交且编码具有环氧化物水解酶活性的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体的基因的核苷酸序列是SEQ IDNO.3所示的序列。

本发明还提供获得所述突变体的方法，是在如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基础上，将第196位的亮氨酸突变成了天冬氨酸(L196D)。

在本发明的一种实施方式中，以携带编码环氧化物水解酶的基因pveh1的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主；培养宿主使之产环氧化物水解酶突变体。

本发明还提供一种表达所述环氧化物水解酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：以携带编码环氧化物水解酶的基因pveh1的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述携带编码环氧化物水解酶的基因pveh1的重组质粒为pET28a(+)-pveh1，表达宿主为E.coli BL21(DE3)。