[发明专利]一种分子探针功能化丙酮酸激酶的纳米传感器快速检测微生物

说明书

海洋病害微生物是影响国民经济建设的重要因素之一，开展病害微生物检测和控制研究对国民经济建设有重大意义。本工作拟研发了一种基于分子探针功能化丙酮酸激酶的纳米传感器结合ATP荧光仪快速超灵敏诊断病原微生物。项目主要内容为：重点设计分子探针功能化丙酮酸激酶与微生物靶点识别机制和反应动力学，考察ATP荧光仪在微生物快速检测和微生物即时表达分析中作用规律。本工作创新性体现在：利用分子探针功能化丙酮酸激酶在分子水平上检测微生物，特别为解决涉及微生物检测方法中“便携式”和“全自动”问题提供参考和借鉴。

技术领域

本发明设计一种分子探针功能化丙酮酸激酶快速检测微生物。

背景技术

进入21世纪以来，感染性疾病仍然是危害人类健康的重大隐患，尤其是第三世界国家。WHO宣布近30年来,新发现了29种新病原体。目前的现状是造成感染性疾病的微生物种类日益复杂，常见病原微生物的威胁不仅没有消除，而且出现了一些耐药性菌株，如葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌等，加之一些新病原体的出现，给临床诊断和治疗带来了很大的困难。2003年SARS引起了全球性灾难和恐慌，今年又接连发生禽流感爆发、猪链球菌感染人类、副溶血弧菌感染和牛炭疽感染人类事件，出现次数越来越频繁等严峻的现实给病原微生物的检测和诊断提出了更高的要求。同时，对病原菌的明确诊断也是合理用药的基础。日常生活中食品微生物检验和诊断是食品质量管理必不可少的重要组成部分，它是贯彻“预防为主”的方针，可以有效地防止或者减少食物人畜共患病的发生，保障人民的身体健康。食品微生物检验是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品是否食用的科学依据之一。通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生情况，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据。

根据世界各国的统计，每年因微生物感染食品造成的直接年经济损失超过2000亿。如采取有效的防措施，微生物导致的损失能够减小三分之一。开展其检测和鉴定方法研究对国民经济建设有重大意义。在ISO4883-2003标准中，微生物鉴定时间被认定为微生物检测技术等级划分的重要参数。因此，采取有效的方法快速检测微生物是降低病原微生物污染的手段。1970年代以来，研究者们根据细菌生物学性状和代谢产物的差异，研制了一系列微量和快速生化反应的微生物检测系统，并实现了从生化模式到数字模式的转化。目前主要微生物检测仪包括Tempo检测仪、Bactrac检测仪、Soleris检测系统、PN-INS32型检测仪、Biolog微生物鉴定系统和BAX System Q7检测系统。Tempo系统基于酶底物荧光计数，Bactract系统基于阻抗，信号影响因素多。Soleris系统也是基于酶底物对培养液颜色的变化进行实时监测。德国 RVLM 微生物快速检测系统、美国biolumix公司的PN-INS32和Soleris检测系统原理相近，同时检测颜色变化和荧光信号。法国生物梅里埃的 Vitek AMS自动微生物检测系统在国内获得了广泛应用, 其对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础, 不同种类的 Vitek检测卡含有多个生化反应孔, 内含 30 种生化试剂, 可接种细胞纯培养基悬液。通过检测悬液孵育过程中的生化反应变化, 将反应结果与电脑中的数据库进行对比, 得出鉴定结果。该系统是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器。绝大多数细菌的鉴定检测时间在 2-18 h, 如鉴定沙门菌属需 4 h, 鉴定志贺氏菌属需 6 h, 鉴定霍乱弧菌等致病性弧菌亦需 4-13 h。Biology系统采用独创的碳源利用方法，用其对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选不同碳源，配合四唑类显色物质，检测其新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致颜色及浊度差异，与标准菌株数据库进行比对，即可得出鉴定结果。美国杜邦的BAX System Q7系统，使用聚合酶链式反应系统检测微生物，系统最多可进行5色荧光同时检测，使单孔检测多种微生物成为可能。美国 3M MDS100 致病菌快速检测仪, 该系统采用环介导核酸等温扩增技术和生物荧光捕获技术, 通过捕获 DNA 扩增反应过程中产生的 ATP 而发出的生物荧光,实现自动化检测DNA 扩增产物, 并以图表和直观检测点两种形式来表示检测结果。美国BIO-RAD 公司在收购的 QuantaLife 公司开发的微滴数字 PCR(ddPCR)技术基础上, 开发了用于微生物核酸检测的 QX100 微滴数字 PCR 仪。德国耶拿开发的 Mobilab 微生物现场快速检测系统, 也是一种全自动的现场使用的 PCR 分析系统, 从样本采集、核酸抽提、高速 PCR 扩增到检测。美国杜邦 RiboPrinter 微生物鉴定系统, 是目前全球唯一自动化的 DNA 指纹仪器, 用于鉴定鉴别微生物并给出 DNA 指纹分子信息。但上述各种微生物检测仪存在以下两个方面的问题：一是体积比较大，无法便携式携带；二是复杂的分析测量操作（需要专门技术培训）。微生物诊断仪的商品化和实验室中微生物检测技术存在技术转化壁垒。因此，研制一种便携式和低成本的微生物检测仪有潜在商业需求。