[发明专利]一种用酵母表达系统生产重组草酸脱羧酶的方法及应用

说明书

本发明提供了一种用酵母表达系统生产重组草酸脱羧酶的方法及应用。通过将真核微生物来源的草酸脱羧酶基因导入到酵母表达系统的宿主细胞中，构建能够高效分泌表达重组草酸脱羧酶的系列工程菌株，将重组菌株发酵培养，不同的重组菌分泌表达的草酸脱羧酶活力可达到5750‑9000IU/L。本发明的生产重组草酸脱羧酶的方法实现了草酸脱羧酶在酵母宿主细胞中高效重组分泌表达，重组草酸脱羧酶具有与天然宿主细胞制备的草酸脱羧酶相似的酶学性质。同时，本发明的重组草酸脱羧酶具有糖基化修饰，pH耐受范围宽，在胃肠环境中稳定性强，半衰期长；分泌表达的蛋白可溶，生产和纯化工艺简单，无内毒素污染，可广泛应用于生物医药、特殊医学配方食品和功能性食品加工等领域。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用酵母表达系统生产重组草酸脱羧酶的方法及应用。

背景技术

草酸(oxalic acid)又名乙二酸，是生物体的一种代谢产物，通常以草酸盐的形式广泛存在于动植物和真菌体中。许多食物的草酸盐含量都比较高，如菠菜、草莓、甜菜、可可、芋头、甘薯、大黄和茶叶等。在人体和其他哺乳动物中，草酸盐是代谢的终产物，没有降解草酸盐的相关酶类，从食物中吸收的外源性草酸盐和由生理代谢产生的内源性草酸盐主要通过肾脏排泄进尿中。人类和其他哺乳动物在长期食用高草酸盐含量的食物时，容易发生草酸盐在人体的血液和尿液中浓度的升高，当与钙离子结合时，会生成不溶的草酸钙。草酸钙是泌尿系结石的主要成分，占比80％以上。另外高浓度的草酸盐还与其他多种病理有关，例如，高草酸尿症，心脏传导障碍、克罗恩病(Crohn’s disease)以及其他肠道疾病状态等。因此，在体外或者体内环境中分解来源于食物中的草酸盐，可显著减少草酸盐在体内的吸收，能降低发生包括尿路结石在内的相关疾病的风险。

近年来，研究酶法降解草酸预防治疗草酸钙结石症等相关疾病成为研究热点。目前生物界已知存在的具有分解草酸功能的酶，包括草酸氧化酶、草酸脱羧酶(以下也称“OXDC”)和草酰CoA脱羧酶。OXDC是一个催化活性中心含有锰离子，能将草酸分解为甲酸和二氧化碳的酶。OXDC最早发现于木腐真菌中(Shimazono，1955)，真菌来源的草酸脱羧酶主要来自于真菌，如黑曲霉、盾壳霉(C.minitans)、金针菇(F.velutipes)、白腐菌(T.versicolor)和褐腐菌(P.placenta)等，细菌中草酸脱羧酶研究得最为透彻的是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的OXDC。但天然草酸脱羧酶在上述原始宿主中表达量非常低，发酵周期长，直接从枯草芽孢杆菌B.subtilis制备和纯化OXDC得率也极低，生产成本很高。目前草酸脱羧酶的重组表达研究主要是在原核细胞中进行，枯草芽孢杆菌YvrK基因来源OXDC虽然成功在原核细胞实现表达，但其表达量比较低，酶活力范围为pH3.0～6.0，pH低于3.0无活力，在胃肠环境中不稳定，应用范围和领域受限。来源于金针菇(C.velutipes)的草酸脱羧酶通过烟草进行表达的表达量极低(参见文献：Meenu Kesarwani,et.al.OxalateDecarboxylase from Collybia velutipes.The Journal ofBiologicalChemistry.2000,275(10):7230–7238)，在原核(E.coli)表达但无酶活力。此外来源于金针菇(C.velutipes)的草酸脱羧酶在酿酒酵母中表达也没有活力(Mohammad Azam et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications.2001,289:807-812)，在粟酒裂殖酵母中虽有非常微弱的活力，但活性蛋白大部分都在胞内，分泌到胞外的酶蛋白很少，活力只有0.1IU左右，根本不具备工业化生产的能力。草酸脱羧酶在本发明之前，还未发现有在酵母宿主细胞中高效分泌表达真核来源重组脱羧酶的报道。

发明内容