[发明专利]一种用酵母表达系统生产重组草酸脱羧酶的方法及应用

权利要求书

1.一种通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建包含草酸脱羧酶基因的酵母表达的DNA载体，所述载体包括整合型表达载体或游离型表达载体中的至少一种，所述整合型表达载体含有编码选择性标记的基因和编码草酸脱羧酶的基因的表达盒，所述游离型表达载体含有编码选择性标记的基因和编码草酸脱羧酶的基因的游离质粒；

2)将包含草酸脱羧酶基因的酵母表达的DNA载体导入酵母宿主细胞，经筛选和鉴定后，分离含有至少一个草酸脱羧酶基因拷贝的重组酵母宿主细胞；

3)在培养基质中培养分离出的重组酵母宿主细胞，所述培养基质使重组酵母宿主细胞能够表达重组草酸脱羧酶，且表达产物能够分泌到培养基质中；

4)从重组酵母宿主细胞培养基质中回收重组草酸脱羧酶。

2.根据权利要求1所述的一种通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述步骤1)中草酸脱羧酶来源于真核生物，包括来源于茶树菇、杨树菇、金针菇、云芝、褐腐菌、琉球曲霉和金福菇中的任一种真核生物的草酸脱羟酶。

3.根据权利要求1所述的一种通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述的草酸脱羧酶表达盒由草酸脱羧酶编码基因、信号肽、来源于酵母的启动子和终止子组成。

4.根据权利要求3所述的一种通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述草酸脱羧酶编码基因是按照酵母宿主细胞偏爱的密码子优化的核苷酸序列。

5.根据权利要求3所述的一种通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述信号肽是能将草酸脱羧酶引导至酵母宿主细胞分泌途径的信号肽编码区。

6.根据权利要求5所述的一种通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述信号肽选自酵母的α-信号肽和蛋白酶信号肽。

7.根据权利要求3所述的一种通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述来源于酵母的启动子选自毕赤酵母AOX1启动子、毕赤酵母GAP启动子、毕赤酵母FLD1启动子、乳酸克鲁维酵母磷酸甘油酸酯激酶启动子、酸性磷酸酯酶启动子、乙醇脱氢酶启动子、β-半乳糖苷酶启动子、粟酒裂殖酵母nmt1启动子、乙醇脱氢酶启动子、fbp1启动子和inv1启动子。

8.根据权利要求1所述的一种通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述酵母宿主细胞选自：毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、类酵母属、假丝酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、红酵母属、球拟酵母属、裂殖酵母属。

9.根据权利要求8所述的一种通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述酵母宿主细胞选自毕赤酵母属、克鲁维酵母属、裂殖酵母属。

10.根据权利要求9所述的一种通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述酵母宿主细胞选自巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母中的至少一种。

11.根据权利要求1所述的一种通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述步骤2)中分离出的重组酵母宿主细胞中包含至少一个拷贝草酸脱羧酶的游离质粒。

12.根据权利要求1所述的一种通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述步骤2)中分离出的重组酵母宿主细胞的基因组中整合了至少一个拷贝草酸脱羧酶基因表达盒。

13.如权利要求1-12中任一项的通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法的应用，其特征在于，所述方法应用于生物医药、特殊医学配方食品和功能性食品加工领域生产重组草酸脱羧酶。

14.根据权利要求13所述的通过酵母宿主细胞生产重组草酸脱羧酶的方法的应用，其特征在于，所述方法应用于制备预防和治疗泌尿系统结石的药物。