[发明专利]谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段及其制备方法和应用。所述片段的制备方法：Trizol法提取谷子幼苗组织mRNA，以mRNA为模板，经酶催化，反转录成cDNA。根据谷子抗肿瘤活性蛋白FMBP质谱鉴定结果，在Genebank中获得该蛋白基因序列，根据其不同的功能区域分别截短筛选，确定Ca²⁺结合位点的基因序列为抗肿瘤效应结构域，以此设计特定引物，以谷子cDNA为模板，PCR法扩增FMBP‑C基因序列；在该序列上下游分别引入BamH I和HindⅢ酶切位点，与pMal‑s载体连接，构建pMal‑s‑FMBP‑C重组质粒，转入E.coli DH5α感受态细胞，筛选获得阳性转化子；经IPTG诱导表达目的蛋白，将其亲和纯化、脱盐和浓缩，MTT法检测其抗肿瘤和逆转肿瘤多药耐药的功能，结果表明该活性片段具有显著的抗肿瘤及逆转肿瘤多药耐药的活性。

技术领域

本发明涉及生物技术和医药领域，具体属于一种谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段及其及其制备方法和应用。

背景技术

谷子，学名：Setaria italica，又称粟，去皮后称为小米，在植物学上属禾本科黍族狗尾草属，起源于中国，是北方的优势农作物，也是山西省的特色农产品之一。谷糠是谷子加工成小米的过程中得到的副产品。目前，对于谷糠的开发和研究并不多。谷糠中含有丰富的营养成分和有益成分。如：甘油三脂、脂蛋白、谷维醇、维生素B、维生素E、葡萄糖、纤维素以及微量元素等。近年来发现谷子中有一系列具有药用价值的活性分子，这些活性分子具有抗氧化活性，抗菌活性，抗高血糖活性等。

国内外尚未见关于谷糠中抗肿瘤活性蛋白分子的研究报道。我们课题组在前期研究中首次发现谷糠来源的过氧化物酶蛋白FMBP具显著的抗肿瘤活性，并已授权国家发明专利。为了降低该天然蛋白在体内可能产生免疫源性，同时也为了该蛋白后期能够进行规模化放大生产，我们通过重组截短优化获得FMBP发挥抗肿瘤效应的活性片段的功能基因、重组蛋白，以及将该重组蛋白在制备抗肿瘤药物以及耐药逆转剂中应用。

发明内容

本发明的目的在于利用基因工程技术，提供一种谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段的基因、重组蛋白及其制备方法，以及该重组蛋白在制备抗肿瘤药物以及耐药逆转剂中的应用。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

一种谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段基因，其特征在于具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

一种载体，其含有如上所述的谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段基因。

一种工程菌，其含有如上所述的载体。

一种谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段的制备方法，包括如下步骤：

(1)将谷子幼苗在液氮中磨成粉末，Trizol法提取总RNA，利用反转录酶获得cDNA模板；

(2)根据谷子抗肿瘤活性蛋白FMBP质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定结果，在Genebank中获得该蛋白基因序列，根据其不同的功能区域分别截短筛选，确定Ca²⁺结合位点的基因序列为抗肿瘤效应结构域，以此设计上下游引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；以cDNA为模板，建立PCR反应体系，回收PCR产物，测序鉴定；

(3)PCR产物经BamH I和HindⅢ双酶切，与同样经过双酶切的pMal-s载体连接，转化E.coli DH5α，获得重组菌株E.coli DH5α-pMal-s-FMBP-C；