[发明专利]谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示的序列。

2.一种载体，其特征在于，含有权利要求1所述的谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段基因。

3.一种工程菌，其特征在于，含有权利要求2所述的载体。

4.一种谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将谷子幼苗在液氮中磨成粉末，Trizol法提取总RNA，利用反转录酶获得cDNA模板；

（2）根据谷子抗肿瘤活性蛋白FMBP质谱鉴定结果，在Genebank中获得该蛋白基因序列，根据其不同的功能区域分别截短筛选，确定Ca²⁺结合位点的基因序列为抗肿瘤效应结构域，以此设计上下游引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；以cDNA为模板，建立PCR反应体系，回收PCR产物，测序鉴定；

（3）PCR产物经BamH I和 HindⅢ双酶切，与同样经过双酶切的pMal-s载体连接，转化E.coli DH5α，获得重组菌株E.coli DH5α-pMal-s-FMBP-C；

（4）重组菌株E.coli DH5α-pMal-s-FMBP- C培养过夜，转接于含有氨苄的LB培养基中，37 ℃，200 rpm/min下培养一段时间后在600 nm处测菌液OD值，当OD值达到0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG，终浓度为0.2-0.4 mmol/L，继续诱导培养4-5 h，离心，收集菌体；

（5）将预装材料Amylose Resin加到空的亲和层析柱子中，用平衡缓冲液平衡柱子；再将菌体超声破碎，离心，将离心后的上清液上样于上述已平衡好的亲和层析柱中进行纯化；

（6）用平衡缓冲液洗脱非特异性结合的杂蛋白，再用含10 mmol/L麦芽糖的平衡缓冲液洗脱目的蛋白，经2-3次反复纯化，PBS过夜透析，10 KD的超滤管浓缩，离心，获得目的蛋白FMBP-C。

5.如权利要求1所述的谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段基因在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为结直肠癌、盲肠癌或宫颈癌。

6.如权利要求1所述的谷糠源过氧化物酶抗肿瘤活性片段基因在制备肿瘤耐药逆转剂中的应用，所述的肿瘤为盲肠癌。