[发明专利]一种用于检测芒果EIF1A基因的引物及实时荧光定量PCR法

说明书

【技术领域】

本发明涉及荧光定量PCR检测方法技术领域，特别涉及一种用于检测芒果EIF1A基因的引物及实时荧光定量PCR法。

【背景技术】

真核翻译起始因子1A(euka ryo tic transla tion initia tion factor,e IF-1A)的功能主要是参与蛋白质合成起始的第1步，即在EIF1A等的参与下使eIF2:GTP:tRNA组成三元复合体，该复合体与40S核糖体亚基结合而启动翻译过程。EIF1A在肽链的合成起始中起重要作用,是重要的蛋白合成调控因子之一。而目前并未发现有关芒果的EIF1A基因在芒果不同组织的分布情况的研究。

荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，也称为定量PCR，简称为QPCR)技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法；一般情况下，为了荧光定量技术保证理想的扩增效率(90％～110％)，要求荧光定量PCR实验的扩增产物长度不宜超过400bp，更理想的最好能在50-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。在文库定量的荧光定量PCR实验中扩增效率会随着扩增产物长度的增加而降低，为保证较好的扩增效率(90％～110％)，荧光定量PCR实验Taqman水解探针法的扩增产物大小最好保持在50bp～150bp。因此文库的片段长度是影响扩增效率的主要因素，而芒果的EIF1A全长序列全长达到604bp，其扩增是有一定难度的，因此，如何能提高扩增效率，更好的应用荧光定量PCR来对芒果不同组织进行定量分析是本申请需要解决的技术问题。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要提供一种有效的方法，能提高扩增效率，更好的应用荧光定量PCR来对芒果不同组织进行定量分析。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于检测芒果EIF1A基因的引物，所述引物包括用于扩增目的基因的目的EIF1A基因引物对和用于扩增内参基因的MiGAPDH基因引物对；

所述EIF1A基因引物对的引物序列如下：

上游引物序列：5’-TCAAGGAAGATGGGCAAGAG-3’；

下游引物序列：5’-ACGGATGTGGCAAAGACG-3’；

所述MiGAPDH基因引物对的引物序列如下：

上游引物序列：5’-CTAGTGGTCCAAGTCTCCAAGAAAA-3’；

下游引物序列：5’-CAAGGGGCTCATCACAAACA-3’。

本申请还提供了一种应用如权利要求1所述引物进行荧光定量PCR检测的方法，所述方法包括：目的基因总RNA提取、目的基因cDNA的合成、荧光定量PCR扩增检测。

进一步的，所述目的基因总RNA提取包括如下步骤：

(1)取不同的芒果组织样品速冻后，分别保存于-70℃～-80℃的冰箱中，分别用氮液将100mg-200mg的不同芒果组织样品研磨成粉，然后转移到2.0mL-3.0mL的离心管I中再加入1mL-2mL细胞裂解液；

(2)在步骤(1)的离心管中加入300μL-600μL的去蛋白液，混匀30s-50s后取下层溶液转入含200μL-400μL氯仿的离心管II中，将离心管II中的液体充分混合混合，并在振荡器上振荡，混匀30s-50s；

(3)将步骤(2)的离心管II放入4℃，12000rpm/min-15000rpm/min的条件下进行离心，离心时间为8min-10min；离心后取上清液500μL-700μL转移到2.0mL-3.0mL离心管Ⅲ中；

(4)加入与步骤(3)离心管Ⅲ中的上清液与等体积的漂洗液，充分颠倒混匀，将混合物，加入离心吸附柱中，在4℃，12000rpm/min-15000rpm/min条件下离心1min-2min，弃掉穿透液；

(5)向步骤(4)离心后的离心吸附柱中加入500μL-700μL的洗柱液，在4℃，12000rpm/min-15000rpm/min的条件下离心1min-2min，弃掉穿透液；然后再向离心吸附柱中加入500μL-700μL洗柱液，再在4℃，12000rpm/min-15000rpm/min离心1min-2min，去除残留的液体；

(6)将步骤(5)的离心吸附柱转移到无RNA酶1.5ml-2ml离心管收集管中，加入50μL-70μL洗脱液，在室温条件下放置5min-8min；