[发明专利]一种用于检测芒果EIF1A基因的引物及实时荧光定量PCR法

权利要求书

1.一种用于检测芒果EIF1A基因的引物，其特征在于，所述引物包括用于扩增目的基因的目的EIF1A基因引物对和用于扩增内参基因的MiGAPDH基因引物对；

所述EIF1A基因引物对的引物序列如下：

上游引物序列：5’-TCAAGGAAGATGGGCAAGAG-3’；

下游引物序列：5’-ACGGATGTGGCAAAGACG-3’；

所述MiGAPDH基因引物对的引物序列如下：

上游引物序列：5’-CTAGTGGTCCAAGTCTCCAAGAAAA-3’；

下游引物序列：5’-CAAGGGGCTCATCACAAACA-3’。

2.一种应用如权利要求1所述引物进行荧光定量PCR检测的方法，其特征在于，所述方法包括：目的基因总RNA提取、目的基因cDNA的合成、荧光定量PCR扩增检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目的基因总RNA提取包括如下步骤：

(1)取不同的芒果组织样品速冻后，分别保存于-70℃～-80℃的冰箱中，分别用氮液将100mg-200mg的不同芒果组织样品研磨成粉，然后转移到2.0mL-3.0mL的离心管I中再加入1mL-2mL细胞裂解液；

(2)在步骤(1)的离心管中加入300μL-600μL的去蛋白液，混匀30s-50s后取下层溶液转入含200μL-400μL氯仿的离心管II中，将离心管II中的液体充分混合混合，并在振荡器上振荡，混匀30s-50s；

(3)将步骤(2)的离心管II放入4℃，12000rpm/min-15000rpm/min的条件下进行离心，离心时间为8min-10min；离心后取上清液500μL-700μL转移到2.0mL-3.0mL离心管Ⅲ中；

(4)加入与步骤(3)离心管Ⅲ中的上清液与等体积的漂洗液，充分颠倒混匀，将混合物，加入离心吸附柱中，在4℃，12000rpm/min-15000rpm/min条件下离心1min-2min，弃掉穿透液；

(5)向步骤(4)离心后的离心吸附柱中加入500μL-700μL的洗柱液，在4℃，12000rpm/min-15000rpm/min的条件下离心1min-2min，弃掉穿透液；然后再向离心吸附柱中加入500μL-700μL洗柱液，再在4℃，12000rpm/min-15000rpm/min离心1min-2min，去除残留的液体；

(6)将步骤(5)的离心吸附柱转移到无RNA酶1.5ml-2ml离心管收集管中，加入50μL-70μL洗脱液，在室温条件下放置5min-8min；

(7)将步骤(6)的离心管收集管在4℃，12000rpm/min-15000rpm/min的条件下离心1min-2min，收集离心管中溶液得到不同芒果组织样品的总RNA。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目的基因cDNA的合成方法为：

将不同芒果组织样品的总RNA样品各取各1μg-2μg做为模板进行逆转录，逆转录完后取5μL-7μL产物进行琼脂糖电泳检测，检测之后可保存于-15℃～-20℃冰箱中，得到不同芒果组织样品的cDNA。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增检测方法为：

将不同芒果组织样品的cDNA为作为定量PCR的模板，以芒果3-磷酸甘油醛脱氢酶基因MiGAPDH为内参基因，以EIF1A基因引物对和MiGAPDH基因引物对分别在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应；

所述PCR反应的反应体系为：

所述PCR反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火20s，共计45个循环，采集荧光信号；95℃变性1s，65℃退火15s，1个循环，制定溶解曲线；40℃冷却30s。