[发明专利]一种用于植物生长素分离纯化的层析柱及分离方法

说明书

本发明公开了一种用于植物生长素分离纯化的层析柱及分离方法，层析柱内的树脂中固定有IAA亲和蛋白，如IAA7蛋白、TIR1受体蛋白和TIR1‑IAA共受体蛋白等中的任意一种。本发明突破了传统方法难以从微量植物样品中有效分离和纯化IAA的困难，解决了传统方法操作复杂、有机抽提不环保和分离纯化效率低的问题，大大提高IAA的分离纯化效率，在植物鲜重为10～50mg情况下能从植物匀浆液中快速一步分离纯化到足量的IAA用于液相‑质谱联用仪检测。本发明中的分离纯化方法大大简化了IAA的分离纯化过程、操作简单并且成本低廉。

技术领域

本发明涉及一种用于分离纯化植物生长素的层析柱及分离方法，尤其是涉及一种基于植物生长素亲和蛋白的层析柱及分离方法。

背景技术

生长素(β-3-吲哚乙酸，简称IAA)是传统五大类植物激素中最早被发现的一种，也是具有相当重要的生物学意义以及应用价值的一种植物生长物质。IAA普遍存在于植物体内，植物细胞一般利用色氨酸合成IAA，高浓度IAA抑制植物生长，低浓度促进植物生长，其对人和动物安全无害，亦无生理作用。目前，IAA的功能及其调控途径的解析已经成为国内外的研究热点，这些研究的前提就是要清楚IAA在植物不同部位的含量。然而，由于IAA在植物中的含量很低、遇光热不稳定，导致了传统的植物激素IAA的分离纯化方法回收效率低，很难满足微量和痕量植物样品中IAA的定量分析的要求，并且传统方法多采用有机抽提来分离纯化IAA，步骤繁复且不环保，所以提供一种从微量和痕量植物样品中高效分离纯化IAA的新方法具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于植物生长素分离纯化的层析柱及分离方法，解决了传统方法操作步骤繁复、有机抽提不环保且回收效率偏低的问题，大大提高IAA分离纯化效率。利用IAA亲和蛋白具有与IAA结合能力强、特异性高的生物学特性，将其应用到IAA的分离层析纯化中，利用生物识别系统而形成的一种新的IAA的分离纯化方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于植物生长素分离纯化的层析柱，层析柱内的树脂中固定有植物生长素亲和蛋白，层析柱的制备包括以下步骤：

1)将植物生长素亲和蛋白注入到树脂中，使亲和蛋白与树脂充分结合，清洗后得到固定有亲和蛋白的树脂；

2)将固定有植物生长素亲和蛋白的树脂注入到空的蛋白质纯化重力柱中，静置后即获得层析柱。

进一步地，植物生长素亲和蛋白选自IAA7蛋白、TIR1受体蛋白、TIR1-IAA共受体蛋白。

进一步地，TIR1-IAA共受体蛋白为TIR1-IAA7共受体蛋白。

进一步地，植物生长素亲和蛋白上带有蛋白标签。

进一步地，蛋白标签为GST标签。

一种使用本发明中的层析柱分离纯化植物生长素的方法，包括以下步骤：

1)将植物初提液注入层析柱，待生长素与植物生长素亲和蛋白充分结合后从纯化柱底部放出多余的液体，清洗柱床，酶切，收集柱床内溶液；

2)将收集的柱床内溶液浓缩干燥得到生长素与植物生长素亲和蛋白的混合物，复溶混合物，离心后取上清即可得到生长素溶液。

进一步地，植物初提液的制备步骤为：液氮速冻后用研磨法充分粉碎植物样品，加入缓冲液混匀，离心，上清即是植物初提液。

进一步地，复溶混合物使用的溶剂为乙腈水溶液。

进一步地，乙腈水溶液的质量分数为20％。

一种定量分析植物中生长素的方法，先使用本发明中的方法分离纯化植物生长素。然后使用液相-质谱联用仪检测分析分离纯化的植物生长素。

本发明的有益效果是：