[发明专利]一种DNA甲基化检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括亚硫酸氢钠、对苯二酚、脱盐柱、0.3摩尔每升的氢氧化钠、醋酸铵、乙醇、三氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、聚乙二醇辛基苯基醚、探针X、探针Y、探针X′、探针Y′、核酸外切酶I、核酸外切酶III、10×NEBufferI、硫酸铵、Cy5标记的报告探针、生物素标记的捕获探针、热稳定连接酶和605量子点。

2.根据权利要求1所述DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述探针X、探针Y、探针X′和探针Y′的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。

3.根据权利要求2所述DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，探针Y在5′末端修饰磷酸基团，3′末端进行修饰磷硫酰化，探针Y′在5’末端进行磷酸基团修饰。

4.根据权利要求1所述DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述Cy5标记的报告探针为：5′-TGA CTC TGT GGA GTC CTG CC-3′，如SEQ ID NO.5所示，其中3’端第四个碱基T碱基上修饰Cy5荧光分子；生物素标记的捕获探针为：

5′-CGA GAC TAG TCA GTA-3′，如SEQ ID NO.6所示，3′末端修饰生物素分子。

5.根据权利要求1-4任一所述DNA甲基化检测试剂盒的使用方法，其特征在于，分为以下步骤：

(1)DNA亚硫酸氢盐处理，将待测DNA在42℃、0.35摩尔每升的氢氧化钠条件下变性30分钟后，进行亚硫酸氢钠反应，反应后利用脱盐柱进行DNA回收，用0.3摩尔每升的氢氧化钠在37摄氏度反应15分钟完成修饰，然后用醋酸铵中和、乙醇沉淀和干燥，将DNA溶液超纯水中20℃保存、备用；

(2)三步循环连接酶链式反应；

(3)核酸外切酶I和核酸外切酶III处理：在三步循环连接酶链式反应(LCR)结束后，在37℃条件下，50单位核酸外切酶I，50单位核酸外切酶III，

10×NEBufferI加入到反应混合物来消化探针X、X′、Y′和X′Y′30分钟，消化反应在90℃孵育10分钟以终止反应，将XY产品存储在4摄氏度；

(4)杂交反应：Cy5标记的报告探针、生物素标记的捕获探针和XY产品在缓冲溶液体系中室温下孵育20分钟获得三明治杂交产物；杂交反应后三明治产物通过生物素-链酶亲和素相互作用组装到605量子点表面来形成605量子点-寡核苷酸-Cy5纳米结构。

6.根据权利要求5所述DNA甲基化检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(1)亚硫酸氢钠反应方法为：将变性后的待测DNA加入到新鲜制备的3.2摩尔每升的亚硫酸氢钠和0.5毫摩尔每升对苯二酚混合液中50℃反应16～18小时。

7.根据权利要求5所述DNA甲基化检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(2)三步循环连接酶链式反应，反应体系为：20毫摩尔每升pH值为8.3的三氨基甲烷盐酸盐、25毫摩尔每升的氯化钾、10毫摩尔每升的氯化镁、0.5毫摩尔每升的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.01％聚乙二醇辛基苯基醚、1微摩尔每升的探针X、1微摩尔每升的探针Y、1微摩尔每升的探针X′、1微摩尔每升的Y′探针和待测DNA，反应体系总体积为20微升；反应条件为：将上述反应体系95℃加热变性3分钟，然后在75℃加入2单位热稳定连接酶，紧接着在95℃反应1分钟后，然后在46摄氏度连接反应，在1分钟内热循环30次。

8.根据权利要求5所述DNA甲基化检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(4)缓冲溶液体系包含100毫摩尔每升三氨基甲烷盐酸盐、10毫摩尔每升硫酸铵和3毫摩尔每升氯化镁，缓冲液pH值为8.0。

9.根据权利要求1-4任一所述DNA甲基化检测试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒可用于在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸和非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸位点进行DNA甲基化的检测。