[发明专利]靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统

说明书

本发明涉及一种靶向肝星状细胞同时双敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统，其在肝星状细胞(HSC)特异性的GFAP启动子控制下能够抑制Pdgfrβ和TβrII基因的表达，且其高度的靶向性和灵敏性，在肝纤维化的治疗方面有很好的临床应用前景。

技术领域

本发明涉及一种靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统，以及它们在治疗肝纤维化方面的应用，属于生物医药领域。

背景技术

肝脏纤维化是大多数慢性肝病的共同特征，以细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的过度累积为特点，肝纤维化进展为肝硬化是发生肝相关的严重疾病及死亡的主要原因。在纤维化的过程中，受伤的肝细胞释放促纤维化细胞因子并激活毗邻的静息肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)，HSCs是响应肝损伤和参与创伤修复的主要的肝间充质细胞类型。HSCs从静息的类似于脂肪细胞的状态分化转化为肌成纤维细胞与其显著的形态学和生物学改变相关，例如收缩、纤维增生加强、胶原过度沉积以及ECM累积。HSCs是所有肝病类型中抗纤维化治疗的主要细胞靶标，调控HSCs活化和增殖的主要的促纤维化信号通路主要有转化生长因子β1(TGF-β1)和血小板源性生长因子(PDGF)通路，都是很有潜力的肝纤维化治疗靶点。

TGF-β1是一个明确的促纤维化细胞因子，它能够促进HSCs的活化。TGF-β1通过在细胞膜上形成II型(TGFβR2或TβRII)和I型(TβRI)丝氨酸/苏氨酸激酶受体复合物来激活HSCs，该复合物随后招募并磷酸化SMAD蛋白。然后活化的SMAD复合物转位进入胞核，调节下游参与HSCs分化转化及细胞凋亡、ECM合成与降解的目的基因的转录。在TGF-β1的控制下，TβRII被激活，I型受体反式磷酸化从而激活它的激酶，因此它是一个启动者，并且是典型TGF-β/SMAD信号通路的关键部分。

当HSCs被激活后，若干生长因子和细胞因子，诸如PDGF，调控活化HSC的增殖。作为激活HSCs的最有效的促有丝分裂细胞因子，PDGF-BB主要结合受体PDGFR-β，激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)以及磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/Akt/P70S6K信号来促进HSCs增殖。

综上，由于在肝脏纤维化中TGF-β1和PDGF通路功能的融合与相互调控，有一些科学家们针对促肝纤维化的细胞因子TGF-β1和PDGF通路中的多种组分，来研发肝纤维化基因靶向治疗的方法，例如，人源化抗体、复合抑制剂、负显性可溶性受体，以及尤其是RNA干扰等。

关于RNA干扰技术，最近一个重大进展就是人工miRNA(artificial microRNA，amiRNA)的应用。这种方法的基本原理是使用设计好的特异定位靶基因的shRNA在pre-miRNA茎环中替换掉成熟miRNA的序列，它可以将人工合成的发夹结构插入到天然miRNA骨架中，使用相同的细胞miRNA生物学机制加工成有效的miRNA。

AmiRNA方案与基于siRNA或shRNA的传统的RNAi方法相比具有若干优点，它具有高度灵敏性、可控性和较少的脱靶效应。

本领域技术人员希望能够开发出一种AmiRNA方案，该方案可以应用于针对TGF-β1和PDGF通路的靶向肝星状细胞的基因治疗。

发明内容