[发明专利]靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统有效
申请号: | 201810009392.6 | 申请日: | 2018-01-05 |
公开(公告)号: | CN108913689B | 公开(公告)日: | 2021-09-07 |
发明(设计)人: | 汪海健;贺福初;姜燕;赵园园 | 申请(专利权)人: | 复旦大学 |
主分类号: | C12N15/113 | 分类号: | C12N15/113;C12N15/867;A61K31/713;A61P1/16 |
代理公司: | 上海智力专利商标事务所(普通合伙) 31105 | 代理人: | 周涛 |
地址: | 200433 *** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 靶向 星状 细胞 pdgfr rii 基因 人工 mirna 及其 载体 系统 | ||
1.一种靶向肝星状细胞的人工miRNA,其特征在于:所述人工miRNA具有miRNA骨架的二级结构,且其包含两个shRNA干扰单位,
其中一个shRNA干扰单位为靶向Pdgfrβ基因的shRNA干扰单位,
另一个shRNA干扰单位为靶向TβrII基因的shRNA干扰单位,
两个shRNA干扰单位之间通过链接序列连接,
其中,所述靶向Pdgfrβ基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.1所示,反义链序列如SEQ ID NO.2所示,并且,所述靶向TβrII基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.3所示,反义链序列如SEQ ID NO.4所示;或者,
所述靶向Pdgfrβ基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.5所示,反义链序列如SEQ IDNO.6所示,并且,所述靶向TβrII基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.7所示,反义链序列如SEQ ID NO.8所示;
所述人工miRNA是在pri-miR-30a骨架基础上进行改造获得的miRNA骨架结构,且两个shRNA干扰单位之间的链接序列的长度为80-100bp。
2.如权利要求1所述的人工miRNA,其特征在于:
所述靶向Pdgfrβ基因的shRNA干扰单位靠近5’端,所述靶向TβrII基因的shRNA干扰单位靠近3’端;且
所述人工miRNA的全长序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
3.一种靶向肝星状细胞的敲低Pdgfrβ和TβrII两个基因的载体系统,其特征在于:
所述载体系统是通过将如权利要求1至2中任意一项所述的人工miRNA插入到一miRNA表达载体的多克隆位点中构建形成。
4.如权利要求3所述的载体系统,其特征在于:
所述miRNA表达载体为慢病毒miRNA表达载体,且其启动子被替换成GFAP启动子。
5.如权利要求4所述的载体系统,其特征在于:
所述GFAP启动子为人GFAP启动子。
6.一种靶向肝星状细胞的载体系统的构建方法,其特征在于:该构建方法包括以下步骤:
步骤1a,人工合成如权利要求1所述的人工miRNA;
步骤1b,提供慢病毒miRNA表达载体:将慢病毒载体pLenti-CMV-microRNA-EGFP-T2A-Puro中的原始启动子替换成人GFAP启动子作为慢病毒miRNA表达载体;
步骤2,将所述步骤1a合成的人工miRNA插入到所述步骤1b提供的慢病毒miRNA表达载体内位于EGFP基因的内含子中的多克隆位点,且所述多克隆位点连接人工miRNA的酶切位点为NdeⅠ和BamHⅠ;
上述步骤1a与步骤1b,两个步骤不分先后。
7.如权利要求1至2中任意一项所述人工miRNA在制备肝纤维化基因治疗药物方面的用途。
8.如权利要求3至5中任意一项所述的载体系统在制备肝纤维化基因治疗药物方面的用途。
9.一种药物组合物,其特征在于:该药物组合物包含如权利要求3至5中任意一项所述的载体系统和药用载体。
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