[发明专利]基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法

说明书

基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，根据长毛明对虾和凡纳滨对虾线粒体基因组全序列，设计扩增细胞色素C氧化酶I(COI)基因片段的引物COIF和COIR；提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA，利用引物COIF和COIR进行PCR反应；将PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，测序验证；利用MEGA7.0比对获得的序列，利用DNAMAN预测各种对虾代表序列的酶切位点；取待放流的长毛明对虾F1代仔虾和亲虾，提取基因组DNA；利用COIF和COIR，对DNA模板F1～F4，P1～P4，V1，V2，Y1，Y2，V1+Y1，V2+Y2进行PCR扩增，将PCR扩增产物酶切，酶切产物进行电泳鉴定。

技术领域

本发明涉及种质鉴定方法，尤其是涉及一种基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法。

背景技术

近年来，由于过度捕捞和环境污染，我国近海岸生态系统受到严重破坏，导致渔业资源逐渐枯竭。渔业资源增殖放流是指通过向渔业资源出现衰退的天然水域投放鱼、虾、蟹、贝等苗种，使其自然种群数量和资源总量得以恢复的一种有效方法(陈睿毅,楼宝,詹炜,等.人工增殖放流技术的探讨[J].河北渔业,2014(5):50-54)。增殖放流不仅有利于恢复渔业种群资源、保护濒危物种、改善水域生态环境，并且能够促进渔业增效、提高渔民的经济收入，同时也是我国社会主义生态文明建设的需要。

近年来，各级政府部门增加对渔业生物资源的投入，逐年扩大人工增殖放流范围的和放流物种种类、数量，已经取得了一定的经济效益(梁君.海洋渔业资源增殖放流效果的主要影响因素及对策研究[J].中国渔业经济,2013,31(5):122-134)。但许多增殖放流项目的效果并不显著，存在许多不规范的问题，比如放流苗种不纯正甚至掺假；放流操作不规范；放流苗种缺乏疾病检测等。所有这些环节都会影响到渔业增殖放流的效果，甚至影响野生种群的遗传多样性。其中放流苗种的来源是首要问题。目前，对虾的增殖放流一般规格为10mm(仔虾)，不同种对虾虾苗在形态上难以区分，不乏一些唯利是图的商人以假乱真，以次充好。目前还没有一种有效快捷的方法用于鉴定放流虾苗是否存在掺杂。

DNA条形码(DNA Barcoding)是指通过分析一段标准的DNA序列对物种进行鉴定(Waugh J.DNA barcoding in animal species:progress,potential and pitfalls.[J].Bioessays News&Reviews in Molecular Cellular&Developmental Biology,2007,29(2):188)。在动物种级水平的物种鉴定中，常用线粒体基因如细胞色素C氧化酶I基因(COI)和16S rRNA等。长毛明对虾(Fenneropenaeuspenicillatus)作为我国重要的海洋经济虾类，近年来受环境变化的影响，资源量急剧下降，在《中国物种红色名录》(2005版)中被列为濒危物种。福建省近十多年来一直开展增殖放流活动，其中对虾品种主要是长毛明对虾，增殖放流成效初显。保证长毛明对虾虾苗的纯正是科学有目的地进行增殖放流的前提，也是改善长毛明对虾野生资源所必需。利用DNA条形码技术可以准确、快速鉴定放流长毛明对虾虾苗中是否掺杂凡纳滨对虾。

发明内容

本发明目的是提供可准确、高效地完成放流长毛明对虾虾苗快速鉴定的基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法。

本发明首先利用细胞色素C氧化酶I(COI)基因通用引物(F:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，R:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)分别扩增10尾凡纳滨对虾和长毛明对虾，利用MEGA7.0比对获得的序列，同时利用DNAMAN(Version9.0)预测各种对虾代表序列的酶切位点。

所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，包括以下步骤：