[发明专利]基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法

权利要求书

1.基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

1)根据长毛明对虾(NC_026885.1)和凡纳滨对虾(NC_009626.1)线粒体基因组全序列，设计扩增细胞色素C氧化酶I(COI)基因片段的引物COIF和COIR；

2)提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA，利用引物COIF和COIR进行PCR反应；

3)将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并测序验证；

4)利用MEGA7.0比对获得的序列，同时利用DNAMAN(Version9.0)预测各种对虾代表序列的酶切位点；

5)取待放流的长毛明对虾F1代仔虾和亲虾，分别提取基因组DNA；

6)利用COIF和COIR，对DNA模板F1～F4，P1～P4，V1，V2，Y1，Y2，V1+Y1(1︰1)，V2+Y2(1︰1)进行PCR扩增，再将所述的PCR扩增产物进行酶切，酶切产物进行电泳鉴定。

2.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤1)中，所述引物为：

COIF：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；

COIR：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。

3.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤2)中，所述提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA，是提取10尾长毛明对虾和10尾凡纳滨对虾的基因组DNA。

4.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤2)中，所述长毛明对虾为Y1～Y10，所述凡纳滨对虾为V1～V10。

5.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤2)中，所述提取的长毛明对虾和凡纳滨对虾的DNA，是采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒DP324，天根产。

6.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤2)中，所述PCR反应体系为：12.5μl2×EasyTaq PCR SuperMix(-dye)，1μl COIF，1μl COIR，1μl DNA，ddH₂O补充至25μl；所述PCR反应程序为：①94℃3min；②40个循环：94℃1min，41℃1min15s，72℃1min30s；③72℃10min。

7.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤2)中，所述长毛明对虾的PCR扩增产物序列为：

8.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤2)中，所述凡纳滨对虾的PCR扩增产物序列为：

其中，A/AGCTT为酶切位点；所述酶切位点可使用HindIII内切酶；所述电泳可采用琼脂糖凝胶电泳；

长毛明对虾和凡纳滨对虾经PCR扩增的产物片段长度为663bp；凡纳滨对虾存在酶切位点AAGCTT，经酶切产生379bp和284bp酶切片段；在长毛明对虾中不存在该酶切位点，故仍存在663bp的条带，若长毛明对虾虾苗中掺杂凡纳滨对虾，则会出现663bp，379bp和284bp3条片段。

9.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤3)中，所述将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，是将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳1％检测。

10.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，其特征在于在步骤5)中，所述取待放流的长毛明对虾F1代仔虾和亲虾，是取厦门翔安欣星海水产养殖专业合作社待放流的4口水泥池的长毛明对虾F1代仔虾和4尾亲虾；所述4口水泥池的长毛明对虾F1代仔虾为F1，F2，F3，F4；所述4尾亲虾为P1，P2，P3，P4。