[发明专利]基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括膜分类基因芯片检测试纸条，膜分类基因芯片检测试纸条包括：Cm探针、Ha探针、Km探针、Ac探针、Kv探针、Pl探针、At探针、Aa探针、PC探针和NC探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.10所示。该试剂盒能同时对海洋环境中的几种常见产毒微藻，包括海洋卡盾藻、赤潮异湾藻、米氏凯伦藻、强壮前沟藻、剧毒卡尔藻、利玛原甲藻、塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻进行高特异性、高灵敏度和快速检测，该检测不需要特殊的仪器，可满足野外现场检测的要求。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒及检测方法。

背景技术

海洋自然环境中存在着大量产毒微藻，根据文献报道，全球4000多种浮游植物中有70多种能产生毒素。我国海域也存在着相当数量的产毒藻类，现有资料显示，分布在我国沿海的产毒微藻至少有30种，且产毒藻种的数量还在不断增加。特别是近二十年来，我国海域有害藻类水华频发，规模之大，危害严重。有害藻类已成为影响海洋生态环境、渔业经济及水产食品健康安全的重要因素。因此，亟待对产毒藻类进行实时监控以减少经济损失并防止公共卫生事件的发生。

目前对海洋环境中的产毒微藻的检测技术主要是形态法及分子生物学方法。根据形态学特征通过光镜对自然水样中的微藻进行定性和计数仍是海洋生态调查及环境监测的主要方法。形态法主要依靠藻类的形态学特征，借助光镜或电镜对藻种进行鉴定，然而，形态鉴定法存在以下缺点：第一、有害微藻一般个体微小，结构精细复杂，其鉴定常需借助电镜且必须要具备丰富的分类学知识和经验才能最终鉴定，造成检测成本及经验依赖度高；第二、很多海洋产毒微藻在实验室培养困难，且形态结构易随自然环境而发生显著变化，更增加了其鉴定难度；第三、海洋环境监控常需处理大量样品，更突显形态检测法耗时费力的局限性；第四、当目标藻细胞在被检样品中含量较低时，传统形态学方法易于造成漏检，而产毒微藻在极低浓度时却可能有较大危害。综上，由于传统的形态鉴定法专业性强、检测成本高、耗时、费力且不适合低浓度样品检测，探讨新的有害微藻的检测方法成为海洋环境监测的热点。

分子生物学技术的发展为有害藻类的鉴定提供了新思路。近年来，出现了大量有关有害微藻的分子检测方法，如荧光原位杂交、“三明治”杂交、核酸酶保护分析结合“三明治”杂交、电致化学发光分子探针技术、荧光定量PCR等，但这些方法都只能对自然样品中的单种有害藻进行检测。然而，分子生物学方法虽较形态法有一定的优势，自然海域生物具有高度多样性，因此自然水样中常有多种有害微藻同时存在，这就要求在日常海洋环境监测时对各种微藻同时检测。因此，最近还出现了多种可对自然样品中的多种有害微藻进行并行检测的基因芯片检测技术，包括光纤、悬珠、传感器和玻片DNA阵列等。但当前的大多分子检测技术只能对自然水样中的单种有害藻种进行检测。虽然当前建立的基因芯片检测技术能对多种产毒藻同时进行检测，但其检测成本高，依赖特殊仪器，且技术要求高，并且由于一些产毒微藻与其近缘种的基因序列差易较小，很难设计出种特异性探针，因此容易出现交叉反应，特别是由于当前的基因芯片技术实用性较差，因此难以推广到基层单位。

总之，分子生物学检测技术存在以下缺点：1)现有的分子检测方法除基因芯片技术除外均只能对自然样品的单种有害藻类进行鉴定和检测，而不能满足多种有害微藻并行检测的实际需要；2)无法实现现场检测：现有分子检测方法必须借助特殊的实验仪器，如荧光原位杂交需要荧光显微镜，实时荧光定量PCR需要荧光定量PCR仪，三明治杂交需要酶标仪等，这就使得这些检测方法只能在实验室才能完成，难以实现对自然水体中有害藻类现场检测的需要。3)现有芯片检测技术的缺点：检测成本高、需要特殊仪器且技术要求高，易出现交叉反应，造成检测结果的假阳性。

可见，当前还没有一项以超分枝滚环扩增标记为基础的海洋产毒微藻的平行检测技术及其相应的试剂盒的报道。

发明内容