[发明专利]基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测的膜分类基因芯片检测试纸条，其特征在于，所述膜分类基因芯片检测试纸条包括：Cm探针、Ha探针、Km探针、Ac探针、Kv探针、Pl探针、At探针、Aa探针、PC探针和NC探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.10所示。

2.一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测的膜分类基因芯片检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)合成如权利要求1所述的Cm探针、Ha探针、Km探针、Ac探针、Kv探针、Pl探针、At探针、Aa探针、PC探针和NC探针；

2)将合成的探针溶于pH 7.5、0.1M的Tris-HCl中，配制成浓度为10μM的溶液，并按加尾反应体系及加尾反应程序对各个探针进行Poly dT加尾；

3)隔着衬纸在尼龙膜上用软铅笔划格，每格大小为0.5×0.5cm²，总体大小2.5×2cm²，共20个格子，沿框线将所用的尼龙膜条剪下；

4)将尼龙膜飘浮于ddH₂O表面，让其吸水后沉入水中，再捞出浸泡于20×SSC溶液中5min，再将膜放置于滤纸上晾干；

5)探针点膜及固定：将步骤2)制备的加尾探针溶液加入到离心管中，离心管共20个，共点样20个，分为4排5列，第一排，标记为1，从左向右依次为A-E，分别对应PC、Ha、Ac、Pl、NC，第二排，标记为2，从左向右依次为A-E，分别对应Cm、Ha、Ac、Pl、Aa，第三排，标记为3，从左向右依次为A-E，分别对应Cm、Km、Kv、At、Aa，第四排，标记为4，从左向右依次为A-E，分别对应NC、Km、Kv、At、PC，用毛细吸管或移液器点样，每个探针样品点样0.5～1μL，自然晾干；将点样后的尼龙膜夹于两层滤纸中间，在80℃烘箱内处理2h，制备得到膜分类基因芯片检测试纸条。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，加尾反应体系具体为：5×TdT缓冲液5.0μL、100mM dTTP 0.5μL、10μM如权利要求1所述的探针10.0μL、80U末端脱氧核苷酸转移酶0.5μL、余量为ddH₂O，以上体积总量为20.0μL；加尾反应程序为：37℃2h，70℃10min；所述20×SSC溶液具体为：NaCl，175.32g；Na₃C₆H₅O₇·2H₂O，88.23g；ddH₂O，1000mL；pH＝7.0。

4.权利要求1所述的膜分类基因芯片检测试纸条在制备基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒方面的应用。

5.一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的膜分类基因芯片检测试纸条；自然样品核酸粗提试剂；10×Taq DNA连接缓冲液；PLP Mix；浓度为40U/μL的Taq DNA连接酶；dNTP Mix；10×Bst DNA聚合酶缓冲液；10μM引物Biotin-P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；10μM引物Biotin-P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；8U/μL Bst DNA聚合酶；杂交液；缓冲液II；碱性磷酸酶标记的生物素抗体；显色剂；

所述的PLP Mix包括Cm-PLP探针、Ha-PLP探针、Km-PLP探针、Ac-PLP探针、Kv-PLP探针、Pl-PLP探针、At-PLP探针、Aa-PLP探针、PC-PLP探针和NC-PLP探针，其核苷酸序列分别如SEQID NO.13-SEQ ID NO.22所示；以上每个探针的浓度均为20pM。