[发明专利]基因组编辑方法

说明书

经基因组编辑的细胞或非人生物的制造方法，包括将(a)基因组编辑对象区域的两端的人工核酸酶系统、和(b)单链DNA导入细胞或非人生物的工序，所述(b)单链DNA包含从5′侧开始以5′侧同源臂序列、供体DNA序列、3′侧同源臂序列的顺序配置的碱基序列，所述5′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的一边的碱基序列的同源序列，且所述3′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的另一边的碱基序列的同源序列。

技术领域

本发明涉及基因组编辑方法等。

背景技术

基因改变小鼠被全世界的研究者用于在个体水平上分析基因功能。特别是条件性敲除小鼠能够细胞组织特异地和时期特异地控制基因表达，因此是最被广泛利用的基因改变小鼠之一。

条件性敲除小鼠通过整合有Cre表达盒的“Cre小鼠”和以loxP序列夹着靶标基因或其一部分的“flox小鼠”交配而制作。该Cre小鼠、flox小鼠的制作中，将到目前为止主要利用小鼠ES细胞，或通过将其一部分、Cre表达盒对ES细胞同源重组而敲入后，将所得的细胞注入小鼠胚泡中，将该胚移植到假孕雌小鼠中，经由嵌合小鼠制作Cre小鼠、flox小鼠。但是，利用ES细胞的同源重组需要熟练的知识和技术，因此仅重组ES细胞的建立就需要数月。另外由于经由嵌合小鼠，所以最终制作条件性小鼠需要1～2年。

近年来，随着新的基因组编辑技术CRISPR/Cas系统的出现，能够不利用ES细胞地用受精卵更简便地进行基因改变。通过受精卵中注入Cas mRNA和指导RNA，指导RNA与靶标部位结合，在该结合部位被诱导的Cas蛋白质将DNA进行双链切断，结果能够在作为靶标的基因中导入突变。这时，通过将单链寡核苷酸(ssODN)一起注入，还可以有效地敲入1～数十碱基长的DNA序列(非专利文献1)。

另一方面，在通过CRISPR/Cas系统制作flox小鼠时，如果能够在2处同时敲入loxP序列则是有效的，但实际上仅在1处敲入loxP序列的情况频发。此时，需要使仅在1处敲入了loxP序列的小鼠增产，对从该敲入小鼠采集的受精卵导入CRISPR/Cas系统，在另1处敲入loxP序列，又要花费近1年。

利用现有的供体载体同时在2处插入loxP序列在理论上也是可能的，但实际上得到flox小鼠的效率不高。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Sander JD,Joung JK.‘CRISPR-Cas systems for editing,regulating and targeting genomes.’,Nat Biotechnol.2014Apr；32(4):347-55.

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题是提供对于比较长的区域的突变或比较长的区域内的多处突变(例如，2处loxP序列的插入)也能够更简便且有效地导入的新的基因组编辑方法。

用于解决课题的手段

本发明者鉴于上述课题进行了深入研究，结果发现，通过使用(a)基因组编辑对象区域的两端的人工核酸酶系统、和(b)单链DNA这2者，能够简便且有效地进行基因组编辑，所述(b)单链DNA包含从5′侧开始以5′侧同源臂序列、供体DNA序列、3′侧同源臂序列的顺序配置的碱基序列，所述5′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的一边的碱基序列的同源序列，且所述3′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的另一边的碱基序列的同源序列。

特别是通过作为人工核酸酶系统使用CRISPR/Cas系统，作为单链DNA使用供体DNA序列包含2处重组酶识别序列的单链DNA，将它们通过电穿孔法导入对象，能够高效率地获得在2个等位基因的基因组编辑对象区域的两端添加了重组酶识别序列的个体。另外，通过作为人工核酸酶系统的导入对象利用包含重组酶表达盒的受精卵，能够大幅缩短目的个体的制作时间。