[发明专利]表达靶向CDK9的RNAi效应子的H-1 PV

说明书

本发明涉及表达针对CDK9基因的RNAi效应子(优选shRNA)的创新的原细小病毒(PV)，其显示出改善的抗癌活性。这些新病毒基于ΔH‑1PV沉默子平台，该平台由原细小病毒H‑1PV组成，其特征在于NS区域内的框内缺失(ΔH‑1PV)并且携带shRNA表达盒，其中shRNA的表达受H1聚合酶III启动子控制。在本发明中，发明人旨在使用ΔH‑1PV沉默子来沉默CDK9基因，该基因的活性通常在癌细胞中失调并且已知有助于肿瘤发生。本发明还提供了包括所述细小病毒的细胞或生物体。

技术领域

本发明涉及表达针对CDK9基因的RNAi效应子(优选shRNA)的创新的原细小病毒(protoparvoviruses，PV)，其显示出改善的抗癌活性。这些新病毒基于ΔH-1PV沉默子平台，该平台由原细小病毒H-1PV组成，其特征为NS区域内的框内缺失(ΔH-1PV)并且携带RNA表达盒，优选shRNA 表达盒，在该表达盒中RNA的表达受H1聚合酶III启动子控制。在本发明中，发明人旨在使用ΔH-1PV沉默子来沉默CDK9基因，该基因的活性通常在癌细胞中失调并且已知有助于肿瘤发生。本发明还提供了包括所述细小病毒的细胞或生物体。

背景技术

RNAi干扰，RNAi效应子和递送

RNA干扰(RNAi)首次被Andrew Fire和Craig Mello在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中识别出来，之后因其发现他们在1998年被授予诺贝尔奖。RNAi的机制基于借助于与靶序列互补的双链RNA的宿主 mRNA的序列特异性降解。RNAi是一种控制基因表达的天然存在的细胞过程，因此在许多细胞过程中起着关键作用，包括发育过程[1]。它也是免疫应答的重要组成部分，保护细胞免受如病毒和转座子等病原体的侵害[2]。在其发现后不久，RNAi技术被用于解决生物学问题和疾病的治疗选择，因为它具有高度的特异性和能力，以实现有效地敲除已知的基因序列[3]。在治疗上，RNAi通过递送小RNA双链体来起作用，包括微小RNA(miRNA) 模拟物、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和Dicer底物RNA (dsiRNA)[4]。所有这四类RNAi效应子目前都在针对包括多种癌症在内的各种疾病的多个I-III期临床试验中进行了测试[5]。

通过RNAi介导的抗癌疗法靶向的基因的实例是KRAS、Polo样激酶1、弗林蛋白酶、Ephrin A型受体和c-myc。大多数临床研究涉及与纳米颗粒(例如脂质纳米颗粒)缀合的siRNA，其与裸siRNA相比具有优异的稳定性。然而，尽管有显著改善，但在注射后的前72小时内观察到siRNA的快速下降，其中大多数siRNA被肝细胞吸收(从注射开始30分钟后已在肝脏中发现注射剂量的大约50％)。因此，siRNA的有效递送仍然是该领域的主要瓶颈[5]。由于大多数递送系统是瞬时的并且在细胞分裂期间siRNA的细胞内浓度被稀释，因此通常需要重复给予siRNA。

短发夹RNA(shRNA)是另一类RNAi效应子[6]。shRNA通常由两个互补的(正义和反义)19-29个碱基对序列组成，所述序列由4-11个受损核苷酸的短茎环(loop)分开。通常，表达受RNA聚合酶(Pol)III启动子 (例如U6、H1)或修饰的pol II启动子控制。转录shRNA后，通过茎环连接的正义链和反义链成对一起形成特征性发夹结构。该结构类似于细胞天然用于调节基因表达并需要核处理的前miRNA(pre-miRNA)[3]。在发现启动子驱动的shRNA表达后，病毒RNAi载体的设计成为可能[7]。用于在癌症基因治疗中递送和表达shRNA的病毒的实例是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和逆转录病毒。然而，大多数这些病毒在复制方面有缺陷，并因此沉默效应仅限于原代感染细胞。

溶瘤病毒和RNAi