[发明专利]用于快速产生用于细胞系开发的同源重组载体的DNA质粒

说明书

本发明提供了用于将转基因DNA插入细胞中的同源重组载体。这些载体缩短了生产时间并允许容易地产生经遗传修饰的细胞。本发明允许用户使用所述同源重组载体来测试多种标签并产生纯合的经修饰细胞系。本发明可用于产生敲除细胞、产生具有敲入基因的细胞系、产生用于针对任何靶标进行药物筛选的细胞系、产生转基因动物，或用于基因治疗。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年11月3日提交的美国临时申请No.62/416,802的优先权，其通过引用整体并入本文。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是在国立卫生研究院(NIH)授予的R03DK105267的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

用于靶向活细胞中DNA的特定序列的酶系统(TALENS、锌指内切核酸酶、CRISPR)的最近发现和发展已经显著地使得对真核生物的基因组进行修饰成为可能。这些酶系统的共同特征是，一旦识别并切割靶DNA序列，则内源DNA修复机器将尝试通过两个主要过程修复双链断裂：第一个过程称为非同源末端连接(None-Homologus End Joining，NHEJ)，其以非常易错的多步骤过程重新连接切割DNA的两端，从而在修复的序列中留下核苷酸的小的插入或缺失。这种天然机制允许通过促进靶基因的第一个外显子的序列中NHEJ来产生基因敲除，从而利用随机突变改变用于蛋白质翻译的阅读框。第二个过程称为同源定向修复(Homology Directed Repair，HDR)，其需要与双链断裂的两端具有同源性的DNA模板来修复切割。该过程不易出错，并且已广泛用于修复或插入遗传疾病的特定突变，或敲入蛋白质标记(例如纯化标签或荧光蛋白)的序列。

用于在DNA的双链断裂后促进HDR的供体模板的大小不同。它们可以简单至小于200个碱基对的单链DNA分子(ssDNA)，或者大至作为供体质粒包含用于切割位点的5′和3′末端的同源重组臂。这些供体载体还包含插入的蛋白质标记的序列和用于表达抗性基因的重组盒，以辅助经修饰细胞克隆的分离。这些供体质粒的构建被认为是费力的并且需要多步骤过程，这可需要数天才能完成。此外，一旦在细胞中诱导基因组修饰，则选择纯细胞克隆可需要使用昂贵的细胞分选设备，这不是每个实验室都具备的；或者依赖于利用针对抗真核抗生素的抗性盒的细胞选择，然后是单细胞稀释，该过程可需要数周才能完成。

因此，本领域需要加速载体产生和纯克隆细胞选择过程的方法和组合物。本发明解决了本领域中这种未满足的需求。

发明内容

在一个实施方案中，本发明涉及同源定向重组(HDR)供体载体，其包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码负选择标记的一个或更多个核苷酸序列和包含插入盒的核苷酸序列，其中所述插入盒包含待插入到细胞的基因组中的核酸序列。

在一个实施方案中，插入盒包含以下的一种或更多种：细胞选择标记序列、蛋白质纯化标签、报道标记序列、启动子序列、P2A接头序列、终止序列、mRNA稳定序列、报道标记序列、细胞选择标记序列、外源基因或其组合。

在一个实施方案中，蛋白质标签是以下之一：几丁质结合蛋白(chitin bindingprotein，CBP)、麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein，MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)、聚(His)、生物素/链霉亲和素、V5标签、Myc标签、HA标签、NE标签、His标签、Flag标签、Halo标签、Snap标签、Fc标签、Nus标签、BCCP、硫氧还蛋白、Snoopr标签、Spy标签、Isopep标签、SBP标签、S标签、Avi标签、钙调蛋白。

在一个实施方案中，报道标记是以下之一：氯霉素-乙酰基转移酶(CAT)、β-半乳糖基转移酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶，碱性磷酸酶和荧光蛋白。在一个实施方案中，荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、mCherry、mRuby3、mtagBFP2和mClover3。