[发明专利]转基因动物和生物生产方法

说明书

本申请提供了包含锚定DNA序列的遗传修饰的非人哺乳动物，所述锚定DNA序列插入泌乳蛋白基因的内源基因座处，其中所述锚定DNA序列包含位点特异性重组酶识别位点。还提供了包含转基因的遗传修饰的非人哺乳动物，所述转基因插入泌乳蛋白基因的内源基因座处，其中所述转基因编码分泌性蛋白并且与所述泌乳蛋白基因的内源启动子可操作地连接，并且其中所述转基因侧接一对位点特异性重组酶重组后位点。所提供的遗传修饰的非人哺乳动物可用于从其所产生的乳中产生分泌性的重组蛋白，所述分泌性的重组蛋白由所述转基因编码。

对相关申请的引用

本申请要求2016年12月29日提交的美国临时专利申请62/439,896的优先权。其全部内容在此参考并入。

基金信息

本发明是在国立卫生研究院授予的基金号GM110822的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

发明领域

本发明主要涉及遗传修饰的非人哺乳动物。更具体地，本发明涉及遗传修饰的非人哺乳动物，其包含编码可经由乳汁(milk)分泌的蛋白质的基因，以及产生这种非人哺乳动物的方法。

背景技术

生物生产是生产基于生物制剂的治疗性药物，例如基于蛋白质的治疗剂如抗体和疫苗，其非常复杂以至于它们必须在生命系统中制得。已经采用了多种方法进行生物生产，包括微生物、动物细胞或植物细胞的培养，和从天然来源如血液和牛奶中纯化。通过转基因技术的组合，可以产生将靶蛋白分泌到乳中的转基因动物，然后从乳汁中纯化出靶蛋白(参见，例如，Gordon等人的美国专利7,045,676和7,939,317)。从乳汁中进行的生物生产的优势包括将单位成本降低5-50倍(使用动物乳时每种蛋白质每克为2-20美元，而使用细胞培养系统则为100美元)、技术要求低(同一个动物可以连续生产乳汁，而细胞培养需要不断地监测和取样)、复杂蛋白质的生产(动物自然携带生产复杂蛋白质所需的细胞机制，而这些复杂蛋白质即使有可能在细胞培养物中得到复制，那也是非常困难的)以及容易从乳汁中纯化出蛋白质(蛋白质能有效地从乳汁中通过，平均产率为53％，纯度为99％)。生物生产的市场近年来发展迅速。在欧盟和美国，被批准的转基因动物生物生产的实例包括在转基因山羊的乳汁中表达的Atryn(抗凝血酶，由LBF生产)(2006年在欧洲批准，2009年在美国批准)和在转基因兔的乳汁中表达的Ruconest(C1抑制剂，由Pharming Group生产)(2010年在欧洲批准，2016年在美国批准)。鉴于对治疗性蛋白质需求的增加以及市场占有率的竞争，需要改进生物生产的技术。

发明概述

在一个方面，本公开提供了遗传修饰的非人哺乳动物，其包含插入泌乳蛋白基因的内源基因座处的锚定DNA序列，其中所述锚序列包含第一位点特异性重组酶识别位点。在某些实施方案中，所述锚定DNA序列还包含第二位点特异性重组酶识别位点。在某些实施方案中，所述第一重组酶识别位点与所述第二重组酶识别位点相同。在某些实施方案中，所述第一重组酶识别位点不同于所述第二重组酶识别位点。在某些实施方案中，所述第一位点特异性重组酶识别位点或所述第二位点特异性重组酶识别位点被选自下组的位点特异性重组酶识别：Cre、Flp、λ整合酶、γ-δ解离酶、Tn3解离酶、Sin解离酶、Gin转化酶、Hin转化酶、Tn5044解离酶、IS607转座酶、Bxb1整合酶、wBeta整合酶、BL3整合酶、phiR4整合酶、A118整合酶、TG1整合酶、MR11整合酶、phi370整合酶、SPBc整合酶、TP901-1整合酶、phiRV整合酶、FC1整合酶、K38整合酶、phiBT1整合酶和phiC31整合酶。在某些实施方案中，所述第一或所述第二位点特异性重组酶识别位点为attP。在某些实施方案中，所述第一或所述第二位点特异性重组酶识别位点为attB。在某些实施方案中，所述第一位点特异性重组酶识别位点是phiC31-attP并且所述第二位点特异性重组酶识别位点是Bxb1-attP，或反之亦然。