[发明专利]使用病毒的基因编辑方法

说明书

提供了一种将多核苷酸序列插入细胞的基因组中的方法。所述方法包括：在所述基因组的靶位点产生双链断裂；和向所述细胞引入病毒。所述病毒包含含有待插入的所述多核苷酸序列或其互补序列的核酸。所述核酸不包含与所述靶位点对应的同源臂或包含与所述靶位点对应的非常短(5～25bp)的同源臂。本申请还提供了一种用于将多核苷酸序列插入细胞的基因组中的组合物。所述组合物包含能够在基因组的靶位点产生DNA双链断裂的位点特异性核酸酶和病毒，所述病毒包含含有所述多核苷酸序列或其互补序列的核酸。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年12月29日提交的美国临时专利申请号62/439,897的优先权，其公开内容通过引用并入本申请。

发明领域

本发明一般地涉及使用病毒进行基因编辑的方法。

背景技术

使用经工程化改造的位点特异性核酸酶(例如，CRISPR、ZFN、TALEN)的基因编辑技术的开发为在包括人在内的高等生物中进行靶向基因修饰打开了大门，并且具有基因治疗的巨大潜力。这种基因编辑技术通常依赖于核酸酶以形成DNA双链断裂(DSB)以及细胞DNA修复机制以产生靶向突变或基因插入(即，敲入)。精确的位点特异性基因插入通常通过同源定向修复(HDR)途径发生，即使在存在DSB的情况下，其也具有较低的重组率。而且，HDR需要供体模板以包括与DSB的翼侧序列同源的序列(同源臂)。

病毒已被广泛用于递送外源性核酸，因此可以将其用于递送用于基因编辑的核酸试剂。然而，就核酸尺寸而言，所有病毒均具有有限的包装能力。由于基于HDR的基因编辑需要含有同源臂的供体模板，因而限制了插入片段的尺寸。例如，腺相关病毒(AAV)(一种常用的基因递送病毒)仅具有长度为～4.7kb的基因组，这使得插入长序列是不切实际的。

因而，对开发使用病毒的新基因编辑技术存在持续的需求。

发明内容

在一个方面中，本公开内容提供了一种将多核苷酸序列插入细胞的基因组的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：在所述基因组的靶位置产生DNA双链断裂；和向所述细胞引入病毒，其中所述病毒包含核酸，所述核酸含有所述多核苷酸序列或其互补序列，其中所述核酸不包含与所述靶位置对应的同源臂。

在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于将多核苷酸序列插入细胞的基因组的组合物。在一个实施方式中，所述组合物包含：能够在所述基因组的靶位置产生DNA双链断裂的位点特异性核酸酶；和病毒，所述病毒包含核酸，所述核酸含有所述多核苷酸序列或其互补序列，其中所述核酸不包含与所述靶位置对应的同源臂。

在某个实施方式中，根据所述靶位置，所述核酸包含微同源臂(5-25bp)。

在某些实施方式中，所述病毒是双链DNA(dsDNA)病毒或在病毒生命周期中具有dsDNA中间体的病毒。所述病毒可以是腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或慢病毒。

在某些实施方式中，所述核酸是单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)或双链RNA(dsRNA)。在某些实施方式中，所述多核苷酸序列编码B-结构域缺失的因子VIII(BDD-F8)。在某些实施方式中，所述多核苷酸序列包含2A序列。在某些实施方式中，所述多核苷酸序列可以编码多个多肽。编码多个多肽的序列可以是通过2A或IRES序列连接的多顺反子。在某些实施方式中，所述多核苷酸序列在其5’末端包含信号肽编码序列。