[发明专利]用于环状共有序列测序的单链环状DNA文库

说明书

本发明是一种通过利用环状捕获分子生成环状单链核酸分子的文库的新型方法。该方法不受靶核酸分子大小限制，并且可以潜在地容纳非常长的分子。该方法可应用于核酸测序，例如纳米孔测序，其中可读取无限长度的模板。

发明领域

本发明涉及核酸测序的领域。更具体地，本发明涉及产生用于单分子测序的环状模板DNA的文库的领域。

发明背景

当前一代的核酸测序方法利用靶分子的文库，由此对每个单独分子进行测序。文库中的每个分子包含待分析的靶序列，其与选择的测序方法和测序仪器所必需的人工序列(“衔接子”)缀合。通常对双链DNA (dsDNA)分子进行单分子测序，所述双链DNA在两侧具有相同的衔接子。通常，对这些分子进行测序，在一次读取中产生来自每个分子的有义链和反义链两者的数据。为了仅从一条链产生测序文库，可以使用用衔接子或夹板环化靶分子。然而，生成环状单链文库的现有方法是低效的并且受原始靶分子的大小限制。无论原始分子大小如何，本文描述的方法都能够有效地生成单链环状核酸分子的文库。

发明概述

在一些实施方案中，本发明是从包含多种双链靶核酸分子的样品制备环状单链靶核酸分子的文库的方法，所述方法包括：将衔接子连接至双链靶分子的每个末端，由此形成衔接子-连接的双链分子；使所述衔接子-连接的双链分子变性，由此形成衔接子-连接的分子的两条链；使捕获分子退火至所述衔接子-连接的分子的每条链，由此形成包含与在所述衔接子-连接的分子的链的5'-末端和3'-末端的衔接子序列杂交的捕获分子的杂合分子，其中所述捕获分子是环状单链核酸分子，其包含与所述衔接子的至少一部分互补的两个序列；延伸衔接子-连接的分子的链的3'-末端，以到达衔接子-连接的分子的链的5'-末端；连接衔接子-连接的分子的链的5'-末端和3'-末端，由此形成包含捕获分子和衔接子-连接的分子的环化链的杂合分子；和将所述捕获分子与衔接子-连接的分子的环化链分离，由此形成环状单链靶核酸分子的文库。

在一些实施方案中，所述衔接子包含至少一个双链区域和至少一个单链区域，其各自包含两条链。在一些实施方案中，所述衔接子包含至少一个条形码和至少一个引物结合位点。在一些实施方案中，所述捕获分子包含与所述衔接子的单链区域的至少一部分互补的两个序列。在一些实施方案中，所述捕获分子包含与所述衔接子的单链区域和双链区域互补的两个序列。在一些实施方案中，所述条形码是多重样品识别条形码(MID)或独特分子识别条形码(UID)。在一些实施方案中，所述引物是测序引物。在一些实施方案中，与所述衔接子的至少一部分互补的序列在所述捕获分子中彼此直径上相对的位置。

在一些实施方案中，所述捕获分子包含条形码、引物结合位点和用于被固体支持物捕获的结合部分中的一种或多种或全部。在一些实施方案中，所述捕获分子是生物素化的。在一些实施方案中，所述捕获分子在结合所述靶分子期间固定化在固体支持物、诸如链霉抗生物素蛋白包被的珠粒或表面上。

在一些实施方案中，本发明是对包含多种靶分子的样品中的靶核酸进行测序的方法，所述方法包括：使用上述方法从所述样品产生环状靶核酸分子的文库，其中所述衔接子进一步包含测序引物的结合位点；使所述测序引物退火至所述结合位点；和延伸所述测序引物，由此获得所述靶核酸的序列。在一些实施方案中，所述测序引物通过DNA聚合酶、诸如Phi29聚合酶延伸。在一些实施方案中，通过测量在引物延伸期间标记的核苷酸的并入来获得序列。在一些实施方案中，通过基于纳米孔的方法获得序列。