[发明专利]通过质谱法测定BRAF突变和野生型BRAF蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种用于测定生物样品中野生型(WT)BRAF蛋白与其蛋白变体之间的摩尔比的方法，其包括以下步骤：a)通过使用丝氨酸蛋白酶消化所述样品，所述丝氨酸蛋白酶特异性地将肽键C‑端切割成谷氨酸残基或将肽键C‑端切割成谷氨酸或天冬氨酸残基，以获得包含由所述蛋白酶消化所述肽产生的肽片段的组合物，其中所述片段的质量在所述野生型(WT)B‑raf蛋白与一种所述BRAF蛋白变体之间不同。b)使用质谱技术定量测定消化野生型(WT)B‑raf蛋白产生的所述肽片段的摩尔量和消化野生型(WT)B‑raf蛋白的变体产生的所述肽片段的摩尔量。以及，c)基于所述定量评估，计算所述WT BRAF蛋白与其所述变体之间的至少一个具体比值。此外，公开了一种用于评估受试者对BRAF相关疾病的给定药物治疗的敏感性的方法。另外，公开了一种治疗患有BRAF相关疾病的受试者的方法。

技术领域

本发明在广义上涉及医学诊断和靶向治疗领域。更具体地，本发明涉及测定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶BRAF序列的氨基酸形态的具体方法；通过质谱方法学研究野生型和突变形式。更具体地，所述方法涉及分析具有诸如第600位氨基酸的点突变的BRAF序列的能力。此外，本发明涉及提供了一种用于制定用激酶抑制剂对黑色素瘤患者进行个性化治疗的决策的临床应用。

背景技术

已知地，当今对癌症医疗日益增加的需求给研究机构带来强的预测和指引去开发能提高成本效率以改善临床结果的新解决方案。为了应对这些挑战，现代医疗正在寻找对患者更有效且更有益、同时更节省成本的治疗患者的方法。监管指令的方针对我们的研究机构来说至关重要，以使研究机构设法满足癌症患者期望更安全、更低死亡率且药物起效更快的药物的要求。

国家卫生研究所(National Institutes of Health)的下属单位国家癌症研究所(National Cancer Institute)和地方的临床医生和科学家已经在研究出和提供蛋白生物标志物发现和验证策略方面取得了广泛进展。这些监管准则为监管机构(例如美国食品和药物管理局；FDA)的批准流程提供了高质量、标准化、灵敏、特异、定量且易于获取的蛋白、肽，或者健康、疾病或治疗反应的其它生物标志物。

众所周知，大约22％的癌症死亡的原因是由于烟草的使用。另外有10％是由于超重和肥胖、不良饮食以及经常缺乏体育锻炼和过度饮酒。其它因素包括某些感染和/或暴露于感染和环境污染。在发展中国家，近20％的癌症是由于感染如乙型肝炎、丙型肝炎和人类乳头状瘤病毒造成的。这些因素至少部分是通过改变细胞的基因和蛋白起作用的。在癌症发病之前，通常需要诸多这样的基因变化。从统计学上说，大约5％至10％的癌症是由于遗传自父母的遗传缺陷造成的。

个性化医疗是针对个体患者量身定制的医学治疗模式。在个性化医疗中，优化的治疗法通常被应用于基于患者遗传背景或其它分子或细胞分析的情况来选择适当的治疗手段。遗传信息、药物遗传学的使用在个性化医疗的某些方面发挥了主要作用，尽管“个性化医疗”这一术语最初是在遗传学背景下产生的，但是其已经扩大到了涵盖所有类型的定向个体读数诊断测试。

以个体为基础筛查和测量每一和各个患者，将能够提供更精确的诊断和个性治疗方案。现代的基因分型提供了个体DNA序列的详细说明；随后可以将该基因组与参考基因组进行比较，以评估可以解释可能的疾病状态的已有遗传变异。

使用“个性化医疗”，通过靶向疗法的精确治疗能够极大地帮助预防性护理的进步。这一点多年来已经得到证实，其中通过对女性分别进行针对BRCA1和BRCA2基因中的某些突变的基因分型，研究了黑色素瘤、乳腺癌或卵巢癌家族史原因的倾向性。

通过对疾病表观的多个源进行识别，其根据基因组内存在的突变进行绘制，表明了在个体中其识别越容易，成功治疗的机会越大。伴随诊断定义为被用于测试针对目标患者组或亚组的药物功效和安全性。在许多情况下，伴随诊断测定有助于提高治疗疗法的效率。